基因免疫技术（Gene immunization technique）
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一、 概 述
(一) 基因免疫的概念
基因免疫(gene immunization)又称DNA免疫或核酸免疫，是指将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA) 与质粒重组后,利用某种方法直接导入动物细胞内,使带有目的基因的表达载体转化到体内,通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生针对该抗原蛋白的抗体并引起特异的免疫应答以达到预防和治疗的目的,因此也将这种免疫制剂称为基因疫苗(gene vaccine)或核酸疫苗(nucleic acid vaccine)。
(二) 基因免疫的特点和优点
1. 基因免疫可根据需要选择目的基因,该基因可以是完整的一组基因或单个基因的DNA,也可以是编码抗原决定簇的一段核酸序列,其表达产物是病原体的有效成分,可引发保护性免疫,这就避免了毒力回升的危险。
2. 基因免疫时产生的抗原多肽,其递呈过程和自然感染时相似,以其抗原天然构象递呈给免疫系统,对于构象型抗原表位引发的保护性免疫尤为重要。而以重组技术合成的蛋白抗原常造成构象型抗原表位的改变或丢失。
3. 基因疫苗具有相同的理化性质,为联合免疫提供了可能。选择编码病毒保守蛋白的基因序列制备疫苗,可使机体获得对异源株的保护性免疫。此外，因质粒DNA可长期在宿主细胞内表达，强化B细胞和T细胞记忆效应，从而使机体获得持续的保护性免疫。
4. 含不同抗原基因的多种质粒可混合使用，它们之间没有干扰，可同时预防多种疾病。
5. 基因疫苗作为一种重组质粒可以在工程菌中大量扩增，其生产比传统的灭活苗、弱毒苗、亚单位苗等要简单，成本要低。
6. DNA疫苗在常温下非常稳定，有利于储藏运输，且接种法简便。
二、轮状病毒VP7基因的基因免疫
（一）材料与方法
1. 质粒与细菌 真核载体pCX-EGFP和含有轮状病毒VP7基因的pCX-EGFP-VP7。质粒的制备、DNA重组均参考分子克隆。菌株E.coli DH5a为质粒的宿主菌。
2. 酶与 试剂 限制性内切酶、连接酶、牛小肠碱性酶(CIP)、DNA纯化 试剂 盒。
3. 细胞表达产物的鉴定 将真核细胞的重组表达质粒pCX-EGFP-VP7的DNA用电击转染CHO细胞，48小时后收获细胞及细胞上清。
4. DNA的制备及小鼠的免疫 质粒载体pCX-EGFP-VP7经酶切鉴定的大量提取DNA，经纯化，作为免疫用DNA。Balb/C小鼠免疫。每只鼠的四头肌注射盐酸普鲁卡因，约20分钟后分组在相同部位肌肉注射约100ug纯化的pCX-EGFP-VP7或pCX-EGFP。2周后,将每组实验鼠分成两部分,一部分按以上方法再次接种同量的DNA，另一部分不再接种，作为对照继续饲养。
5. 免疫小鼠抗体水平的测定 将免疫的小鼠编号，分为载体质粒及重组表达质粒的再次和初次免疫，每隔2周眼球取血一次，共取5次，保存血清。用ELISA方法检测抗体产生情况。观察抗体水平动态变化。
6．表达pCX-EGFP-VP7的质粒DNA与基因工程CHO细胞表达的抗原蛋白免疫原性的比较。
（二）、CHO细胞表达VP7的免疫原性测定
1．经腹腔注射免疫6只4周龄的Balb/C小鼠，大约0.5ml(60ug)VP7抗原与等量佐剂混合用，每间隔14天再免疫两次，于末次免疫第4、6周取鼠血，测定抗体。
2．免疫荧光法检测抗体 用B95-8细胞涂片，分别取用DNA和抗原蛋白免疫小鼠4、6周后的血清，待检血清从1:10开始倍比稀释至1:160，用抗轮状病毒的单克隆抗体作为阳性对照，分别用荧光标记的羊抗鼠IgG抗体孵育后，用 荧光显微镜 观察结果。
(一) 基因免疫的概念
基因免疫(gene immunization)又称DNA免疫或核酸免疫，是指将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA) 与质粒重组后,利用某种方法直接导入动物细胞内,使带有目的基因的表达载体转化到体内,通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生针对该抗原蛋白的抗体并引起特异的免疫应答以达到预防和治疗的目的,因此也将这种免疫制剂称为基因疫苗(gene vaccine)或核酸疫苗(nucleic acid vaccine)。
(二) 基因免疫的特点和优点
1. 基因免疫可根据需要选择目的基因,该基因可以是完整的一组基因或单个基因的DNA,也可以是编码抗原决定簇的一段核酸序列,其表达产物是病原体的有效成分,可引发保护性免疫,这就避免了毒力回升的危险。
2. 基因免疫时产生的抗原多肽,其递呈过程和自然感染时相似,以其抗原天然构象递呈给免疫系统,对于构象型抗原表位引发的保护性免疫尤为重要。而以重组技术合成的蛋白抗原常造成构象型抗原表位的改变或丢失。
3. 基因疫苗具有相同的理化性质,为联合免疫提供了可能。选择编码病毒保守蛋白的基因序列制备疫苗,可使机体获得对异源株的保护性免疫。此外，因质粒DNA可长期在宿主细胞内表达，强化B细胞和T细胞记忆效应，从而使机体获得持续的保护性免疫。
4. 含不同抗原基因的多种质粒可混合使用，它们之间没有干扰，可同时预防多种疾病。
5. 基因疫苗作为一种重组质粒可以在工程菌中大量扩增，其生产比传统的灭活苗、弱毒苗、亚单位苗等要简单，成本要低。
6. DNA疫苗在常温下非常稳定，有利于储藏运输，且接种法简便。
二、轮状病毒VP7基因的基因免疫
（一）材料与方法
1. 质粒与细菌 真核载体pCX-EGFP和含有轮状病毒VP7基因的pCX-EGFP-VP7。质粒的制备、DNA重组均参考分子克隆。菌株E.coli DH5a为质粒的宿主菌。
2. 酶与 试剂 限制性内切酶、连接酶、牛小肠碱性酶(CIP)、DNA纯化 试剂 盒。
3. 细胞表达产物的鉴定 将真核细胞的重组表达质粒pCX-EGFP-VP7的DNA用电击转染CHO细胞，48小时后收获细胞及细胞上清。
4. DNA的制备及小鼠的免疫 质粒载体pCX-EGFP-VP7经酶切鉴定的大量提取DNA，经纯化，作为免疫用DNA。Balb/C小鼠免疫。每只鼠的四头肌注射盐酸普鲁卡因，约20分钟后分组在相同部位肌肉注射约100ug纯化的pCX-EGFP-VP7或pCX-EGFP。2周后,将每组实验鼠分成两部分,一部分按以上方法再次接种同量的DNA，另一部分不再接种，作为对照继续饲养。
5. 免疫小鼠抗体水平的测定 将免疫的小鼠编号，分为载体质粒及重组表达质粒的再次和初次免疫，每隔2周眼球取血一次，共取5次，保存血清。用ELISA方法检测抗体产生情况。观察抗体水平动态变化。
6．表达pCX-EGFP-VP7的质粒DNA与基因工程CHO细胞表达的抗原蛋白免疫原性的比较。
（二）、CHO细胞表达VP7的免疫原性测定
1．经腹腔注射免疫6只4周龄的Balb/C小鼠，大约0.5ml(60ug)VP7抗原与等量佐剂混合用，每间隔14天再免疫两次，于末次免疫第4、6周取鼠血，测定抗体。
2．免疫荧光法检测抗体 用B95-8细胞涂片，分别取用DNA和抗原蛋白免疫小鼠4、6周后的血清，待检血清从1:10开始倍比稀释至1:160，用抗轮状病毒的单克隆抗体作为阳性对照，分别用荧光标记的羊抗鼠IgG抗体孵育后，用 荧光显微镜 观察结果。
