红细胞免疫功能检测技术（Erythrocyte immune function detection technique）
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一、原理
人和多种动物红细胞与白细胞一样，也具有重要的免疫功能。其基础是红细胞表面具有C 3b 受体（C 3b R）。红细胞可通过其表面的C 3b R，发挥清除免疫复合物（IC）、促进吞噬、提呈抗原及激活补体等多种作用。因此，建立的检测红细胞免疫功能的各种方法，也多以红细胞表面的C 3b R为基础设计的。现已建立的主要有红细胞C 3b R花环及IC花环试验、红细胞SPA酵母混合花环试验、单克隆抗体Coombs试验、抗C 3b R单克隆抗体法、ELISA、放射配体结合法、红细胞促吞噬作用测定法等。
本实验以红细胞C 3b R花环及IC花环试验和红细胞SPA酵母混合花环试验为例，介绍红细胞免疫功能的检测方法。C 3b R酵母花环试验用于检测红细胞C 3b R，原理为用小鼠等血清（补体）致敏后的酵母菌，使菌体表面吸附C 3b ，可与红细胞表面的C 3b R结合，从而将酵母细胞吸附在红细胞周围形成花环。红细胞IC酵母花环试验用于检测红细胞表面的IC，原理为红细胞表面的C 3b R可与体内形成的抗原—抗体—补体复合物种的补体成分结合，而将免疫复合物吸附在其表面，而酵母细胞也可与免疫复合物中的补体成分结合，从而被吸附于细胞表面形成花环。而红细胞SPA酵母混合花环试验的原理为，葡萄球菌A蛋白能与红细胞膜上粘附的IC中的IgGFc片段相结合，而补体致敏的酵母菌能与红细胞膜上未粘附IC的C 3b R相结合，各自形成花环。
红细胞C 3b R和免疫复合物花环率可作为红细胞免疫粘附功能的指标，如二项指标都低下，判为原发性细胞免疫功能低下，为红细胞C 3b 受体受到破坏和影响所致；如果红细胞C 3b R花环率低，而红细胞IC花环率高，为继发性红细胞免疫功能低下，是由于循环免疫复合物增加，红细胞粘附IC过多引起。红细胞SPA酵母混合花环试验可同时显示4种免疫功能状态不同的红细胞，SPA菌体花环为已全部被IC或抗RBC抗体粘附的红细胞；酵母菌花环为未粘附IC或抗RBC抗体的红细胞；混合花环为部分粘附IC或少许抗RBC抗体，并且C 3b 受体有空位的红细胞；裸红细胞为未粘附IC或抗体，并且C 3b 活性低（不能粘附补体致敏酵母菌）的红细胞。
二、材料与 试剂
离心机、恒温水浴箱、显微镜、计数器、小离心管、血细胞计数管。酵母 试剂 、Hank’s液、豚鼠血清、动物抗凝血、姬姆萨氏染色液。金黄色葡萄球菌SPA阳性株为Cowan I （ATCC12598或NCTC8530），阴性株为Wood46株等。
三、操作方法
1．红细胞C 3b R花环试验
（1）C 3b 致敏酵母悬液制备：将酵母试剂用Hank’s液（含钙、镁、pH值7.2，下同）洗1次（1 000r/m离心10min），配成含酵母细胞1.00×108/ml的悬液，加等量新鲜豚鼠血清，混匀，37℃水浴20min。然后再以Hank’s液洗2次，恢复原浓度，即为C3b致敏酵母细胞悬液。酵母试剂用Hank’s液洗涤后，配成1.00×108/ml浓度，即为非致敏酵母悬液。
（2）红细胞悬液制备：将人或鼠、兔、牛、鸡等被检动物的肝素抗凝血，用Hank’s液洗3次（每次以2 000r/min离心5min），最后将红细胞用Hank’s液稀释成1.25×10 7 细胞/ml的悬液。
（3）检测方法：取C 3b 致敏酵母菌悬浊液和红细胞悬液各50μl，混匀，于37℃水浴40min后取出，轻轻摇起，加0.25%戊二醛溶液20μl固定5min，用适量Hank’s液稀释，涂片，干燥，甲醛固定，姬姆萨氏染色，高倍镜检查。
2．红细胞IC酵母花环试验除酵母细胞不致敏外，其余同红细胞C3bR花环试验。
3．红细胞SPA酵母混合花环试验
⑴ 金黄色葡萄球菌SPA阴性和阳性菌的培养和悬液制备：以常规方法在普通琼脂培养基上培养金黄色葡萄球菌SPA阴、阳性菌，以Hank’s液洗下，经活菌计数使之达到6.25×10 3 个菌/ml即为菌悬液。
⑵ 补体致敏酵母菌和红细胞悬液的制备：同红细胞C3bR花环试验。
⑶ 检测方法：在小 离心管 内加入上述待测细胞悬液50μl，补体致敏酵母菌悬液50μl混合，置37℃ 水浴 30min，再加50μl SPA阴、阳性菌悬液混匀，37℃ 水浴 30min，取出水平涂片，姬姆萨氏染色，显微镜油镜检查。
四、结果判定
1．红细胞C 3b R花环试验和IC酵母花环试验 以1个红细胞粘附2个或2个以上酵母细胞为1个花环，计数200个红细胞，求出花环率。正常情况下，两个试验均会看到在红细胞周围粘附几个酵母细胞形成的花环，且红细胞C 3b R花环率大大高于红细胞IC酵母花环率。如正常情况下，人的两种花环率分别为25%～35%和3%～8%，鸡的两种花环率分别为9%～19%和3%～6%。但发生各种传染病及肿瘤性疾病时，两种花环率会发生变化。
2．红细胞SPA酵母混合花环试验 红细胞上粘附2个以上酵母菌为C 3b 花环；粘附10个以上SPA菌体为IC花环；同时粘附10个SPA菌和2个酵母菌以上者为混合花环；未粘附SPA菌体与酵母菌者为裸红细胞。计数200个红细胞，算出各自花环率。涂片染色后红细胞为红色，酵母菌为蓝色，SPA菌体为小的浅蓝色。
五、注意事项
1．不同动物来源的补体对本试验结果影响很大，因此检测不同种属来源的红细胞，应采用不同动物的补体，如检测人的红细胞应用豚鼠 血清 作补体，检测鸡的红细胞应以家兔 血清 作补体，检测牛的红细胞应以小鼠血清作补体，补体来源不对，很难形成花环。
2．补体血清及被检红细胞应现采现用，不能马上使用的，可暂存于4℃冰箱内，但一般不超过6小时。
3．试验管从水浴中取出摇匀时，要以腕力轻轻摇匀，不可振摇，涂片时，应用毛细管吸1小滴于玻片上，并用平放的毛细管轻轻涂开即可，不可来回反复涂抹。
4．所用Hank’s液pH值要调整准确，否则不易形成花环。
5．所用的SPA菌株最好是购买的标准菌株冻干制剂，经分离培养和纯培养之后再使用。
人和多种动物红细胞与白细胞一样，也具有重要的免疫功能。其基础是红细胞表面具有C 3b 受体（C 3b R）。红细胞可通过其表面的C 3b R，发挥清除免疫复合物（IC）、促进吞噬、提呈抗原及激活补体等多种作用。因此，建立的检测红细胞免疫功能的各种方法，也多以红细胞表面的C 3b R为基础设计的。现已建立的主要有红细胞C 3b R花环及IC花环试验、红细胞SPA酵母混合花环试验、单克隆抗体Coombs试验、抗C 3b R单克隆抗体法、ELISA、放射配体结合法、红细胞促吞噬作用测定法等。
本实验以红细胞C 3b R花环及IC花环试验和红细胞SPA酵母混合花环试验为例，介绍红细胞免疫功能的检测方法。C 3b R酵母花环试验用于检测红细胞C 3b R，原理为用小鼠等血清（补体）致敏后的酵母菌，使菌体表面吸附C 3b ，可与红细胞表面的C 3b R结合，从而将酵母细胞吸附在红细胞周围形成花环。红细胞IC酵母花环试验用于检测红细胞表面的IC，原理为红细胞表面的C 3b R可与体内形成的抗原—抗体—补体复合物种的补体成分结合，而将免疫复合物吸附在其表面，而酵母细胞也可与免疫复合物中的补体成分结合，从而被吸附于细胞表面形成花环。而红细胞SPA酵母混合花环试验的原理为，葡萄球菌A蛋白能与红细胞膜上粘附的IC中的IgGFc片段相结合，而补体致敏的酵母菌能与红细胞膜上未粘附IC的C 3b R相结合，各自形成花环。
红细胞C 3b R和免疫复合物花环率可作为红细胞免疫粘附功能的指标，如二项指标都低下，判为原发性细胞免疫功能低下，为红细胞C 3b 受体受到破坏和影响所致；如果红细胞C 3b R花环率低，而红细胞IC花环率高，为继发性红细胞免疫功能低下，是由于循环免疫复合物增加，红细胞粘附IC过多引起。红细胞SPA酵母混合花环试验可同时显示4种免疫功能状态不同的红细胞，SPA菌体花环为已全部被IC或抗RBC抗体粘附的红细胞；酵母菌花环为未粘附IC或抗RBC抗体的红细胞；混合花环为部分粘附IC或少许抗RBC抗体，并且C 3b 受体有空位的红细胞；裸红细胞为未粘附IC或抗体，并且C 3b 活性低（不能粘附补体致敏酵母菌）的红细胞。
二、材料与 试剂
离心机、恒温水浴箱、显微镜、计数器、小离心管、血细胞计数管。酵母 试剂 、Hank’s液、豚鼠血清、动物抗凝血、姬姆萨氏染色液。金黄色葡萄球菌SPA阳性株为Cowan I （ATCC12598或NCTC8530），阴性株为Wood46株等。
三、操作方法
1．红细胞C 3b R花环试验
（1）C 3b 致敏酵母悬液制备：将酵母试剂用Hank’s液（含钙、镁、pH值7.2，下同）洗1次（1 000r/m离心10min），配成含酵母细胞1.00×108/ml的悬液，加等量新鲜豚鼠血清，混匀，37℃水浴20min。然后再以Hank’s液洗2次，恢复原浓度，即为C3b致敏酵母细胞悬液。酵母试剂用Hank’s液洗涤后，配成1.00×108/ml浓度，即为非致敏酵母悬液。
（2）红细胞悬液制备：将人或鼠、兔、牛、鸡等被检动物的肝素抗凝血，用Hank’s液洗3次（每次以2 000r/min离心5min），最后将红细胞用Hank’s液稀释成1.25×10 7 细胞/ml的悬液。
（3）检测方法：取C 3b 致敏酵母菌悬浊液和红细胞悬液各50μl，混匀，于37℃水浴40min后取出，轻轻摇起，加0.25%戊二醛溶液20μl固定5min，用适量Hank’s液稀释，涂片，干燥，甲醛固定，姬姆萨氏染色，高倍镜检查。
2．红细胞IC酵母花环试验除酵母细胞不致敏外，其余同红细胞C3bR花环试验。
3．红细胞SPA酵母混合花环试验
⑴ 金黄色葡萄球菌SPA阴性和阳性菌的培养和悬液制备：以常规方法在普通琼脂培养基上培养金黄色葡萄球菌SPA阴、阳性菌，以Hank’s液洗下，经活菌计数使之达到6.25×10 3 个菌/ml即为菌悬液。
⑵ 补体致敏酵母菌和红细胞悬液的制备：同红细胞C3bR花环试验。
⑶ 检测方法：在小 离心管 内加入上述待测细胞悬液50μl，补体致敏酵母菌悬液50μl混合，置37℃ 水浴 30min，再加50μl SPA阴、阳性菌悬液混匀，37℃ 水浴 30min，取出水平涂片，姬姆萨氏染色，显微镜油镜检查。
四、结果判定
1．红细胞C 3b R花环试验和IC酵母花环试验 以1个红细胞粘附2个或2个以上酵母细胞为1个花环，计数200个红细胞，求出花环率。正常情况下，两个试验均会看到在红细胞周围粘附几个酵母细胞形成的花环，且红细胞C 3b R花环率大大高于红细胞IC酵母花环率。如正常情况下，人的两种花环率分别为25%～35%和3%～8%，鸡的两种花环率分别为9%～19%和3%～6%。但发生各种传染病及肿瘤性疾病时，两种花环率会发生变化。
2．红细胞SPA酵母混合花环试验 红细胞上粘附2个以上酵母菌为C 3b 花环；粘附10个以上SPA菌体为IC花环；同时粘附10个SPA菌和2个酵母菌以上者为混合花环；未粘附SPA菌体与酵母菌者为裸红细胞。计数200个红细胞，算出各自花环率。涂片染色后红细胞为红色，酵母菌为蓝色，SPA菌体为小的浅蓝色。
五、注意事项
1．不同动物来源的补体对本试验结果影响很大，因此检测不同种属来源的红细胞，应采用不同动物的补体，如检测人的红细胞应用豚鼠 血清 作补体，检测鸡的红细胞应以家兔 血清 作补体，检测牛的红细胞应以小鼠血清作补体，补体来源不对，很难形成花环。
2．补体血清及被检红细胞应现采现用，不能马上使用的，可暂存于4℃冰箱内，但一般不超过6小时。
3．试验管从水浴中取出摇匀时，要以腕力轻轻摇匀，不可振摇，涂片时，应用毛细管吸1小滴于玻片上，并用平放的毛细管轻轻涂开即可，不可来回反复涂抹。
4．所用Hank’s液pH值要调整准确，否则不易形成花环。
5．所用的SPA菌株最好是购买的标准菌株冻干制剂，经分离培养和纯培养之后再使用。
