荧光抗体的制备实验

（二） 荧光素

1． 荧光色素的基本条件

（1）具有化学活性基团，如异硫氰基（-NCS）等，易与免疫球蛋白结合形成共价键。

（2）对免疫球蛋白无毒性，不影响抗体活性。

（3）荧光效应高，与蛋白结合需要量少。

（4）荧光素性能稳定，结合物性能稳定，容易贮藏。

（5）结合物的颜色必须与背景组织有良好的反衬作用，易于观察判定。

到目前为止，基本符合上述要求的荧光素只有异硫氰酸荧光素（FITC），丽丝胺罗丹明B ₂₀₀ （RB ₂₀₀ ）。

2．常用的荧光色素

（1）异硫氰酸荧光素 ：又称异硫氰酸荧光黄，纯品为橙黄色粉末。分有结晶型与粉末型两种,结晶型荧光强度大、稳定、优于粉末型。分子式C ₂₁ H ₁₁ O ₂ N ₅ 、分子量389，溶于水，易溶于pH8-9.5碳酸盐缓冲液中。最大吸收波长为495nm。最大发射波长520nm。异硫氰酸荧光黄性质稳定，于低温下可保存二年以上，但久置标记抗体能力弱，荧光亮度差，故应采用新产品。

异硫氰酸荧光素借助异硫氰基与蛋白中氨基酸（主要是赖氨酸）的氨基结合。一个IgG分子有86个氨基酸残基，一般最多能标记16～20个荧光素分子。

（2）丽丝胺罗丹明：为褐色粉末，不溶于水、易溶于酒精和丙酮。荧光为桔红色。性质稳定，可长期保存。分子式C ₂₃ H ₂₉ O ₇ NaS ₂ ，分子量为580，最大吸收波长570nm，最大发射波长为600nm。

由于丽丝胺罗丹明荧光效能较低，一般不单独使用，多用于与FITC标记抗体的反衬染色或双标记配合使用。此染料不能直接与蛋白质结合，必须先用五氯化磷（PCl ₅ ）处理，使染料的-SO ₃ Na基变为-SO ₃ Cl基后，才能在碱性条件下与赖氨酸的氨基结合，形成稳定的硫氨键。

（三） 标记方法

异硫氰酸荧光素常用的标记法有以下两种：

1． 搅拌法

（1）取一定量的纯IgG液，用0.5Mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液稀释至20mg/ml。

（2）按荧光素与蛋白质比1︰20～1︰100（一般用1︰100）称取异硫氰酸荧光素，用pH9.5碳酸盐缓冲液溶解。

（3）将球蛋白液置于电磁搅拌器上，启动开关，轻轻搅拌，以不起沫为准。逐滴加入荧光素液（约10min～15min加完）。加完后，随时用试纸测定搅拌液的pH值，若低于9.0，则应以碳酸钠溶液调整。置4℃搅拌6h～12h即可。

2． 透析法  免疫学实验技术论坛   http://bbs.bbioo.com/forum-140-1.html

（1）将IgG液以0.5Mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液稀释成1%浓度，装入透析袋中。

（2）将荧光素配成0.1mg/ml，其量为1%蛋白液的10倍，装入烧杯中。

（3）将透析袋置于烧杯中，放电磁搅拌器上4℃搅拌24即可。

透析法的优点是标记均匀，非特异性荧光少，但所标记的时间长，荧光素的用量多，约比搅拌法多10倍。

3．影响标记的因素

（1）荧光素与蛋白质的比值：这也取决于荧光素的质量与保存期。一般而言，粉末状荧光素以0.025mg/mg～0.05mg/mg蛋白质为宜，而结晶型则只需0.006mg/mg～0.008mg/mg蛋白质即可。

蛋白含量以20mg～25mg/ml为宜，浓度过低标记过慢。浓度过高，标记效果不好。不过在实践中，以稍高一些蛋白浓度为好。

（2）pH值：以pH9.0～9.5为最好。过低标记速度慢，过高蛋白质容易变性。

（3）温度和时间：温度4℃～25℃均可。温度与时间是成正比的，温度低，反应慢，温度高，反应快。4℃需要6h～12h，7℃～9℃需要3h～4h，20℃～25℃只需要1h～2h。实践中可自选。透析法还是以4℃较长时间反应为好。

（4）荧光素的质量及有效期。

（四）标记抗体的纯化

标记后溶液是一个混合体，它包括蛋白质与荧光素的结合体，还有游离的荧光素、游离的蛋白质以及结合过多的蛋白质。对于某些细菌性的诊断荧光抗体，则只要去除游离的荧光素即可。对于一般组织染色荧光抗体，则要去除过度标记的抗体即可。只是对某些特殊要求的组织染色 试剂 ，则必须经过仔细的处理，包括具有特异性交叉反应或非特异性反应性的除去。

1． 去除游离的荧光素

（1）透析法：将标记好的抗体放入透析袋中于0.01Mol/L pH7.6 PBS中或生理盐水中4℃透析数天，每天换液数次，直至透析液中无游离色素为止。通常约需5～7天才能透析完毕。

（2）凝胶过滤：以G ₂₅ 或G ₅₀ 葡聚糖凝胶装柱进行过滤。次法速度快，一般1h～2 h即可完成。也可以先透析4h～5h，让大部分游离荧光素除去，再过G ₂₅ 或G ₅₀ 柱。

2． 去除过度标记的蛋白质分子 可采用DEAE—纤维素过柱法。利用阶梯洗脱法进行，具体方法如下：

（1）以0.01Mol/L pH 7.6 PB液洗脱。

（2）以0.01 Mol/L pH 7.6 PBS液（0.05Mol/L NaCl）洗脱。

（3）以0.01 Mol/L pH7.6 PBS（0.1Mol/L NaCl）洗脱。

（4）以0.01 Mol/L PH 7.6PBS（0.2Mol/L NaCl）洗脱。