荧光抗体的制备

1   荧光素与抗体结合（标记）
  2   荧光抗体的纯化
  3   荧光抗体的鉴定
  
1.荧光素与抗体结合方法：
    ⑴ 透析法：①适用于蛋白质含量低、样品体
                    积小的抗体溶液的标记
                ②标记较均匀，非特异荧光较低
  
    ⑵ 搅拌法：①适用于蛋白质含量较高、样品
                    体积较大的抗体溶液的标记
                ②标记时间短、效率较高，荧光
                    素用量节省
                ③影响因素多，非特异荧光较强
~undefined透析法

第一步：   将含10mg/ml的Ig溶液10ml
              装入透析袋。
第二步：   将上述透析袋放入烧杯中 ：
              含0.1mg/ml FITC的
              pH=9.4的碳酸盐缓冲液100ml。
第三步：   4℃磁力搅拌24h。
第四步：   取出透析袋，进行纯化、鉴定

~undefined搅拌法

第一步：   将含40mg/ml BP 溶液5ml
              装入反应瓶中。
第二步：   加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐
              缓冲液4ml               
  第三步：   25℃磁力搅拌下，逐滴加入
              1ml含2mg的FITC溶液
第四步：   25℃下搅拌1h，4℃下继续搅拌
            4h，然后进行纯化、鉴定
2. 荧光抗体的纯化：
  ⑴ 除去未结合荧光素
  ⑵ 除去标记不适当的抗体
  ⑶ 除去非特异反应物质

  ****~Kbr_~H~M~2~1~0    (1)除去未结合荧光素：
  
  A 透析法：
  将标记后的抗体溶液装于透析袋，于流动的自来水中透析约10min，然后移入pH=7.4的磷酸盐缓冲 液中，在4℃下透析，直至透析外液在紫外灯下不呈现荧光为止。
  B 凝胶过滤法：
  葡聚糖凝胶G25或G50，用pH=7.4的0.01%PBS溶胀后装柱，加入标记后的抗体溶液，然后用上述PBS洗脱，取洗脱液加入20%三氯醋酸使蛋白沉淀后，上清液中的荧光素应低于0.01ug/ml.
  
    (2)除去标记不适当的抗体：
      采用DEAE纤维素离子柱。将DEAE纤维素用pH=7.6的0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡装柱，加入标记抗体溶液，进行分步洗脱。
      未结合荧光素的抗体，所�负电少，最先洗出。
      过量结合荧光素的抗体，所�负电多，最后洗出。

    (3)除去非特异反应物质：

    将荧光抗体用同一正常组织或同种动物其它组织的组织粉预先吸收。
    按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在用50mg/ml比例重复一次。
   
    3. 荧光抗体的鉴定：
    ⑴ 抗体含量测定：双扩法

    ⑵ 结合比率(F/P)测定：
      分光光度法，并按下式计算：
      FITC:   F/P=2.87×A495/(A280-0.35×A495)
      RB和TRITC:     F/P= A515 / A280
         F/P值高则抗体分子结合的荧光素多。
       固定标本染色以F/P=1.5左右为宜
       活细胞染色以F/P=2.4左右为宜