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125I标记单克隆抗体技术

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同位素标记是一种重要的抗体标记技术,牨977年Yalow等在放射免疫测定法所作突出贡献而获得医学和生理学诺贝尔奖。McAb标记同位素后除应用于放射免疫测定外,还可用于竞争结合试验、体内肿瘤定位等。

(一) 原理

氯胺桾即对甲苯碘氯胺钠,在水溶液中生成次氯酸,为一种温和氧化剂,当加入到有蛋白质和碘的弱碱水溶液中,可将I2氧化为I+并结合到氨基酸上。如标记条件温和,标记后的McAb仍具有良好的结合活性,通过放射性同位素强度的测定可反映相应抗原的含量。

(二) 方法

      在细胞冻存管内加入纯化的McAb100μg/100μl,
      再加入10μl 0.05M磷酸缓冲液
      再加入10μl(含1mCi) 125 I

↓

      加入10μl氯胺-T(5mg/ml溶于0.05M
      磷酸盐缓冲液),孵育时间不超过30秒

↓

      加入100μl偏重亚硫酸钠(1.2mg/ml溶于
      0.05M磷酸缓冲液)

↓

      加入200μl KI溶液(少许结晶KI溶于0.05M
      磷酸缓冲液+4%牛血清白蛋白)

↓

      用PD10柱(Sephadex G25)除去游离 125 I
      用4%BSA PBS洗脱

↓

分部收集,0.5ml/管

每管取5μl进行γ计数,计算标记抗体的比活性和标记率

           结合于McAb125I放射性强度(cpm)
    标记率(%)=───────────────────
              总放射性强度(cpm)

                结合于某一管McAb上的放射性强度
    比活性(μCi/μgMcAb)=────────────────
                    某一管McAb总量

  (三) 试剂器材  免疫学实验技术论坛   http://bbs.bbioo.com/forum-140-1.html

1. 纯化后的McAb

2. 0.05M磷酸缓冲液,氯胺桾,偏重亚硫酸钠,KI,BSA

  3.  125 I

4. 有通风装置的超净台,γ计数仪

5. PD10柱(Sephadex G25)

(四) 注意事项

  1. 严防同位素污染,工作人员必须穿着工作衣,戴口罩、帽子、手套。必须在严密的通风橱或通风超净台中操作。操作前后对实验室环境进行监测。所用 125 I和标记物应妥善保管。

  2. 如标记细胞因子、激素等,应选用更温和的标记方法,使保持更好的 生物 学活性。

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