免疫细胞化学的有关技术概述

一、抗体的制备和配制

（一）抗体的制备

这是免疫细胞化学技术的首要试剂，必需制备具有很高特异性和敏感性的高效价抗体，这将在本书第二章　中详述。目前国内外市场各种特异性抗体日益增多，许多实验室直接应用市售产品，现在我国自制抗体种类少，发展抗体生产十分必要。尤其要定位一种新的抗原物质，能够自制较好。

（二）抗体的配制 

包括抗体贮存液和抗体使用液的配制方法。新制备或购进的是原液或冻干品，抗血清为全血清，单克隆抗体是培养上清液或腹水。

1．抗体贮存　　获得新抗体后，应先根据生产厂家提供的抗体效价，将其分装，可每10μl或100μl/支分装入安瓿或0.25ml带盖塑料管中，密封。放入-20。C~40。C冰箱中保存备用，一般可保存1~2年。小量分装的抗体可1次用完，避免反复冻融而影响效价的降低。一般用前新鲜配制使用液体，稀释的抗体不能长时间保存，在4。C可存入1~3天，超过7天效价显著降低。

2．抗体使用液的配制　　这是任何免疫细胞化学方法中最重要的一环，无论是一抗、二抗和各种标记抗体，用前都必须按不同免疫染色方法和抗原性强弱与抗原的多少，稀释使用的各种抗体原液，以便获得最佳免疫染色结果。

（1）抗体最佳稀释度的测定方法：用已知阳性抗原切片，进行免疫染色，将其阳性强度与背景染色强度以“+”表示，可分为++++、+++、++、+、（-）。++++为最强阳性，+++为强阳性，++为较强阳性，+为弱阳性，（-）为阴性。

①直接测定法：用于测定第一抗体的最佳稀释度，其它条件稳定可靠。将一抗稀释为1：50、1：100、1：2001：400、1：500等5个稀释度滴加在阳性抗原切片上，同时设一替代和阴性对照，结果如表1-1：

表 1-1 选择最佳稀释抗血清方法

一抗稀释度	特异性染色强度	非特异性背景染色度
1：50	++++	++
1：100	++++	++
1：200	++++	++
1：400	+++	+
1：500	++	（-）
阴性对照	（-）	（-）

从表中结果可见，第一抗体稀释到1：400时阳性结果呈强阳性，背景染色减少，其最佳稀释度在1：400~500之间。再作1：420、1：440、1：460、1：480、1：500稀释后染色，找出最佳稀释度。

②棋盘（方阵）测定方法：当测定两种以上抗体的最佳配合稀释度时，必须采用此法（见表1-2）。

表1-2 两种以上抗体最佳配合稀释度选择表

第二抗体	第 一 抗 体
1：500	1：1000	1:2000	1：4000
1：100	++++（++）	++++（+）	+++（±）	+（-）
1：200	++++（+）	+++（-）	++（-）	++（-）
1：400	++（-）	+（-）	-	-

括号内为背景染色结果