免疫组织细胞染色技术

一、概述
免疫细胞化学（immunocytochemistry）或称免疫组织化学（immunohistochemistry），是指用经标记的特异性抗体在组织细胞原位通过特异性抗原抗体反应和化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。它将抗原抗体免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像与放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种细胞组织成分，如蛋白质、多肽、核酸、部分类酯、多糖、激素、病原体（寄生虫、细菌病毒）、受体、神经介质、肿瘤的标记物（抗原或相关抗原）等。一般认为，凡具有抗原性或半抗原性物质都可以用免疫细胞化学方法检查并显示出来，并可在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察其性质定位，还可以利用细胞分光光度计、图像分析仪、共聚焦显微镜等进行细胞原位定量测定。

• 免疫组织细胞染色技术发展的简要历史

    Coons及其同事于1941年首次应用荧光素标记的抗体检测肺组织中的肺炎双球菌获得成功，揭开了免疫细胞化学技术的新篇章。随后，Nakane建立了酶标记的抗体技术，而Sternberger在此基础上进一步通过改良所建立起来的辣根过氧化酶-抗过氧化物酶（PAP）技术使得免疫细胞化学技术得到了广泛的应用。等到上世纪80年代，抗生物素-生物素（ABC）法、免疫金-银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术等相继诞生，进一步丰富了免疫化学技术的内涵，使之成为当今生物医学中重要的研究手段，在生物基础研究、临床诊断发挥着重要作用。

• 免疫组织细胞染色技术的基本过程

免疫组织化学的全过程包括：（1）抗原的提取与纯化；（2）免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；（3）标记抗体的制备；（4）组织细胞标本的制备；（5）免疫细胞化学反应及呈色反应；（6）结果的观察与分析。有关抗原的提取与纯化、抗体的制备与纯化的方法请参考相关免疫学实验技术手册，本文将结合不同类型的免疫细胞化学技术选择性介绍标记抗体的制备、组织细胞标本的制备、免疫化学反应等技术过程。
二、组织细胞标本的制备 免疫学实验技术论坛   http://bbs.bbioo.com/forum-140-1.html
（一）细胞标本的取材
1、体细胞取材方法

1. 印片法：主要用于从活组织检查标本和手术切除标本中获取细胞。首先将标本剖开，最大程度暴露组织病变区，然后将载玻片轻压于病变组织区，吸附脱落的细胞。
2. 穿刺取样涂片法：用细针穿刺从实质性器官（如肝、肾、脾、淋巴结、软组织、骨髓）的病变区吸取病变区的体液，然后进行涂片。
3. 体液沉淀涂片法：主要适用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等含细胞较少的标本，先通过离心获取细胞沉淀，经适当稀释后再进行涂片。

2、培养细胞取材方法
（1）  细胞爬片法：适合于贴壁生长的培养细胞。将干净的盖玻片放置入培养液中，细胞便会自然贴附在其上。
（2）  涂片法：适合于悬浮生长的培养细胞。直接取悬浮生长的培养细胞或通过离心收集细胞，再经适当的洗涤和稀释后进行涂片。
3、组织材料的获取
主要通过组织切片技术获得。根据包埋剂的不同可分为：冰冻切片、石蜡切片、塑料切片、超薄切片、碳腊切片等类型。
（二）细胞和组织的固定
固定的目的是为了更好地将细胞和组织的原有形态结构及成分保留下来，让蛋白质变性，使内源性消化酶失活。对免疫组化而言，可用的固定剂种类多样，性能也不尽相同，在使用时应注意考虑不同固定剂对抗原的影响，防止抗原的弥散以及活性的丢失。
常见的固定剂有醛类（如10％的中性缓冲福尔马林，4％的多聚甲醛等）、非醛类（如碳化二亚胺、对苯醌等）、丙酮及醇类固定剂。常见的固定方法有浸入法和灌注法等。