免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术
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免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。免疫荧光技术包括荧光抗体技术和荧光抗原技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
(一) 原理与方法 免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影
(二) 荧光抗体的制备
1.免疫血清的制备及免疫球蛋白的提纯 制备高效价的特异性抗血清是免疫荧光技术成功的前提。为此，用于免疫的抗原必须高度提纯，尽可能不含其他非特异性的抗抗原物质，血清的效价与特异性是矛盾的，通常以高效价的免疫血清为好，因为用这种血清制备荧光抗体，即使其中含有少量非特异抗体，也可以通过稀释法将其除去。为提高血清效价，在制备免疫原时，通常采用大剂量加佐剂，长程免疫，其中以弗氏不完全佐剂最常用。即按抗原1份，无水羊毛脂1份，液体石蜡2份混合，待充分乳化后，免疫动物，即可能获得高效价的免疫血清。用于荧光素标记的免疫血清，需提纯后使用，这样不但可以提高抗体的效价，而且还可以排除γ球蛋白以外的蛋白质，减少非特异性荧光的出现。从免疫血清中将特异性抗体提纯于荧光素标记是免疫荧光技术的关键一环。在免疫荧光技术中所应用的特异性抗体，主要是IgG类，其提纯方法很多，但以饱和硫酸铵盐析法比较简便，也可用分子筛层析法（即葡聚糖凝胶过滤），以及离子交换层析法等，或先用盐析法精提，然后再经过层析柱进一步纯化。
2.荧光色素的标记 能够产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光色素或荧光染料。用于标记抗体的荧光色素，必须具有化学上的活性基因，能与蛋白质稳定结合，且不影响标记抗体的生物活性及抗原抗体的特异性结合。适于标记蛋白的荧光色素主要有异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC），四乙基罗达明（rho-damine B200，RB200）和四甲基异硫氰基罗达明(tetramethyl rhodamine isotheynate，TMRITC)。实际上目前应用最多的只有异硫氰酸荧光黄一种。
(1) FITC标记 FITC为黄色结晶形粉末，分子量为389，易溶于水和酒精等溶剂中，溶解后呈黄绿色荧光，最大吸收光谱为490-495nm，FITC的溶液不稳定，易因水解或迭聚而变质，故需在配好后2h内应用。
FITC含有异硫氰基，在碱性条件下能与IgG的自由氨基（主要是赖氨酸的ε-氨基）结合，形成荧光抗体结合物。一个分子的IgG有86个赖氨酸残基，但一般最多只能标记15-20个。
① 直接标记法 取抗体球蛋白溶液10ml，碳酸盐缓冲液3ml，生理盐水17ml，混合，在4℃电磁搅拌下加FITC3mg（先溶解在3ml缓冲液中），在4℃继续搅拌4-6h，将结合物通过已平衡好的Sephadex G25柱，以除去未结合的游离荧光素。
② 透析标记法 将抗体球蛋白溶液用碳酸盐缓冲液（0.25mol/L，pH9.0调动1% (W/V )，并装入透析袋中，按蛋白质量的1/20称取FITC溶于10倍抗体溶液量的碳酸盐缓冲液中，将透析袋浸没于FITC液中，于4℃搅拌16-18h取出透析袋于0.01mol/L，pH7.2PBS中透析4h，将结合物通过已平衡好的Sephadex G25柱，去除游离荧光素。
(2) RB200标记 本品为无定形褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存，分子量为580，最大吸收光谱为570nm，呈明亮的橙色荧光，因与FITC的黄绿色有明显区别，故被广泛用于对比染色或用于两种不同颜色的荧光抗体的双重染色。方法为：取1g RB200及五氯化磷（PCL5）2g放乳钵中研磨5min（在毒气操作橱中），加 10ml无水丙酮，放置5min，随时搅拌，过滤，用所得溶液进行结合。将每亳升血清用1ml生理盐水及1ml碳酸盐缓冲液（0.5mol/L，pH9.5）稀释，逐滴加入0.1ml RB200溶液，随加随搅拌，在0-4℃继续搅拌 12-18h。
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
(一) 原理与方法 免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影
(二) 荧光抗体的制备
1.免疫血清的制备及免疫球蛋白的提纯 制备高效价的特异性抗血清是免疫荧光技术成功的前提。为此，用于免疫的抗原必须高度提纯，尽可能不含其他非特异性的抗抗原物质，血清的效价与特异性是矛盾的，通常以高效价的免疫血清为好，因为用这种血清制备荧光抗体，即使其中含有少量非特异抗体，也可以通过稀释法将其除去。为提高血清效价，在制备免疫原时，通常采用大剂量加佐剂，长程免疫，其中以弗氏不完全佐剂最常用。即按抗原1份，无水羊毛脂1份，液体石蜡2份混合，待充分乳化后，免疫动物，即可能获得高效价的免疫血清。用于荧光素标记的免疫血清，需提纯后使用，这样不但可以提高抗体的效价，而且还可以排除γ球蛋白以外的蛋白质，减少非特异性荧光的出现。从免疫血清中将特异性抗体提纯于荧光素标记是免疫荧光技术的关键一环。在免疫荧光技术中所应用的特异性抗体，主要是IgG类，其提纯方法很多，但以饱和硫酸铵盐析法比较简便，也可用分子筛层析法（即葡聚糖凝胶过滤），以及离子交换层析法等，或先用盐析法精提，然后再经过层析柱进一步纯化。
2.荧光色素的标记 能够产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光色素或荧光染料。用于标记抗体的荧光色素，必须具有化学上的活性基因，能与蛋白质稳定结合，且不影响标记抗体的生物活性及抗原抗体的特异性结合。适于标记蛋白的荧光色素主要有异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC），四乙基罗达明（rho-damine B200，RB200）和四甲基异硫氰基罗达明(tetramethyl rhodamine isotheynate，TMRITC)。实际上目前应用最多的只有异硫氰酸荧光黄一种。
(1) FITC标记 FITC为黄色结晶形粉末，分子量为389，易溶于水和酒精等溶剂中，溶解后呈黄绿色荧光，最大吸收光谱为490-495nm，FITC的溶液不稳定，易因水解或迭聚而变质，故需在配好后2h内应用。
FITC含有异硫氰基，在碱性条件下能与IgG的自由氨基（主要是赖氨酸的ε-氨基）结合，形成荧光抗体结合物。一个分子的IgG有86个赖氨酸残基，但一般最多只能标记15-20个。
① 直接标记法 取抗体球蛋白溶液10ml，碳酸盐缓冲液3ml，生理盐水17ml，混合，在4℃电磁搅拌下加FITC3mg（先溶解在3ml缓冲液中），在4℃继续搅拌4-6h，将结合物通过已平衡好的Sephadex G25柱，以除去未结合的游离荧光素。
② 透析标记法 将抗体球蛋白溶液用碳酸盐缓冲液（0.25mol/L，pH9.0调动1% (W/V )，并装入透析袋中，按蛋白质量的1/20称取FITC溶于10倍抗体溶液量的碳酸盐缓冲液中，将透析袋浸没于FITC液中，于4℃搅拌16-18h取出透析袋于0.01mol/L，pH7.2PBS中透析4h，将结合物通过已平衡好的Sephadex G25柱，去除游离荧光素。
(2) RB200标记 本品为无定形褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存，分子量为580，最大吸收光谱为570nm，呈明亮的橙色荧光，因与FITC的黄绿色有明显区别，故被广泛用于对比染色或用于两种不同颜色的荧光抗体的双重染色。方法为：取1g RB200及五氯化磷（PCL5）2g放乳钵中研磨5min（在毒气操作橱中），加 10ml无水丙酮，放置5min，随时搅拌，过滤，用所得溶液进行结合。将每亳升血清用1ml生理盐水及1ml碳酸盐缓冲液（0.5mol/L，pH9.5）稀释，逐滴加入0.1ml RB200溶液，随加随搅拌，在0-4℃继续搅拌 12-18h。
