杂交瘤技术又称单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)
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1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与
生物
学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊断、预防和治疗提供了新的方法。
1. 杂交瘤的基本原理 杂交瘤技术又称单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)。杂交瘤技术是使免疫动物的脾细胞在聚乙二醇（Polyethylene Glycol ，PEG）的诱导下与同系动物的骨髓瘤细胞融合。首先是细胞质融合，然后通过有丝分裂细胞核合而为一，形成新的杂交细胞，简称为杂交瘤。细胞融合后移入HAT培养液中培养。骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGRPT），在HAT培养液中不能增殖而死亡。淋巴细胞培养中也不能长期在培养液中生长增殖。然而杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了HGPRT的基因产物，并从骨髓瘤细胞中获得肿瘤细胞不断生长繁殖（传代）的特性，因此在HAT培养液中选择性存活下来。细胞融合后既具有产生特异性抗体的能力。又保留了瘤细胞能体外长期培养的特性。
2. 杂交瘤细胞制备
（1）骨髓瘤细胞的培养：骨髓瘤细胞（NS-1或SP2/0）在含10～15的小牛血清完全培养液中培养处于对数生长期时，此时细胞浑圆、透亮，大小均一，排列整齐，呈半致密分布。选择处于旺盛生长，形态良好的对数生长期细胞供融合用。
（2）免疫小鼠：选用8～12周龄雌性BALC/C小鼠免疫。如抗原为可溶性（蛋白质），可按每只鼠一次剂量为10～100μg/只免疫。蛋白质抗原与等量弗氏完全佐剂充分混匀，分别注入鼠的颈背部多处或腹腔内，间隔2～4周同法重复，经1月后，再用10～100μg（0.1～0.2ml）抗原作静脉或腹腔加强免疫。细胞与微 生物 表面抗原一般具有较高的免疫原性，可不加佐剂，直接经腹腔或静脉注入（1～2）×107细胞。一般采用融合前3～4d大剂量静脉注入抗原，然后取脾做融合实验。因此间脾脏B淋巴母细胞-浆细胞比例较高，融合率较高。
（3）脾细胞制备：①放血处死小鼠，浸泡在75%的酒精中消毒。②在无菌条件下取脾，至含培养液的小平皿内，去掉脂肪和结缔组织，用5ml无血清培养液冲洗一次。③将脾细胞置细胞网上，加入5ml不完全培养液。用注射器内芯研磨分散脾细胞，将脾细胞收集到 离心管 内（50ml），加10～20ml培养液，离心（800～1000r／min，10min），弃上清后计数备用。
（4）饲养细胞制备：在体外培养时，单个或少数分散的细胞不容易存活与繁殖，必须在加入其他活细胞才易存活与繁殖。通常在融合的前一天或当天用取小鼠腹腔巨噬细胞制作饲养层细胞。
①放血处死小鼠，浸泡在75%的酒精中消毒。②小心剪开腹部皮肤，用小镊子挑起腹膜，注入5ml无血清培养液，用镊子轻揉腹腔，将注入液体回抽，反复注入、抽吸2～3次。③将收集的细胞悬液注入50ml的 离心管 中，加20ml无血清培养液洗涤一次。④用含血清培养液（HAT）15～20ml调至4×105个细胞/ml，用吸管混匀后，接种到96孔板，每孔加0.1ml，置于37℃、5%CO2孵箱中。
（5）细胞融合（杂交） ：①分别吸取含107个骨髓瘤细胞和108个脾细胞悬液，加入50ml的离心管中，充分混匀，并加1640培养液至20ml，离心（1000 r／min，10min）。②弃上清，用手指轻击离心管底部，使沉淀混匀如糊状。然后置37℃水浴中。③取预热37℃的50% PEG 0.7ml，1min内在37℃水浴中边滴边摇动加入离心管中，使细胞保持在均匀状态。然后在37℃水浴中静置1.5min。④立即在2min内加37℃预温的RPMI 1640培养液15ml，以稀释PEG而失去的作用。开始要一滴一滴加，即可见细胞凝集成小块。操作宜轻柔，不损伤细胞，以免影响细胞融合。⑤以1000 r／min，离心7min，弃上清液，加25ml HAT培养液，轻轻混匀，滴加入含有巨噬细胞饲养液的96孔板中，每孔0.1ml。
3. 杂交瘤细胞的选择性培养
（1）培养：将融合后的细胞悬浮于HAT培养液中，置于含5%～7% CO2，37℃饱和湿度培养箱中培养。
（2）换液：每2～3天更换一半量的培养液一次，在融合两周内使用HAT培养液，在第12～13天用HT培养液，在第14天后根据细胞增殖情况改用15%～20%FCS完全培养液。
在停用A后，残留于培养液或细胞内的A仍起一定的阻抑作用，此时需继续补加HT培养液，为杂交瘤细胞提供应急的DNA合成途径。
1. 杂交瘤的基本原理 杂交瘤技术又称单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)。杂交瘤技术是使免疫动物的脾细胞在聚乙二醇（Polyethylene Glycol ，PEG）的诱导下与同系动物的骨髓瘤细胞融合。首先是细胞质融合，然后通过有丝分裂细胞核合而为一，形成新的杂交细胞，简称为杂交瘤。细胞融合后移入HAT培养液中培养。骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGRPT），在HAT培养液中不能增殖而死亡。淋巴细胞培养中也不能长期在培养液中生长增殖。然而杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了HGPRT的基因产物，并从骨髓瘤细胞中获得肿瘤细胞不断生长繁殖（传代）的特性，因此在HAT培养液中选择性存活下来。细胞融合后既具有产生特异性抗体的能力。又保留了瘤细胞能体外长期培养的特性。
2. 杂交瘤细胞制备
（1）骨髓瘤细胞的培养：骨髓瘤细胞（NS-1或SP2/0）在含10～15的小牛血清完全培养液中培养处于对数生长期时，此时细胞浑圆、透亮，大小均一，排列整齐，呈半致密分布。选择处于旺盛生长，形态良好的对数生长期细胞供融合用。
（2）免疫小鼠：选用8～12周龄雌性BALC/C小鼠免疫。如抗原为可溶性（蛋白质），可按每只鼠一次剂量为10～100μg/只免疫。蛋白质抗原与等量弗氏完全佐剂充分混匀，分别注入鼠的颈背部多处或腹腔内，间隔2～4周同法重复，经1月后，再用10～100μg（0.1～0.2ml）抗原作静脉或腹腔加强免疫。细胞与微 生物 表面抗原一般具有较高的免疫原性，可不加佐剂，直接经腹腔或静脉注入（1～2）×107细胞。一般采用融合前3～4d大剂量静脉注入抗原，然后取脾做融合实验。因此间脾脏B淋巴母细胞-浆细胞比例较高，融合率较高。
（3）脾细胞制备：①放血处死小鼠，浸泡在75%的酒精中消毒。②在无菌条件下取脾，至含培养液的小平皿内，去掉脂肪和结缔组织，用5ml无血清培养液冲洗一次。③将脾细胞置细胞网上，加入5ml不完全培养液。用注射器内芯研磨分散脾细胞，将脾细胞收集到 离心管 内（50ml），加10～20ml培养液，离心（800～1000r／min，10min），弃上清后计数备用。
（4）饲养细胞制备：在体外培养时，单个或少数分散的细胞不容易存活与繁殖，必须在加入其他活细胞才易存活与繁殖。通常在融合的前一天或当天用取小鼠腹腔巨噬细胞制作饲养层细胞。
①放血处死小鼠，浸泡在75%的酒精中消毒。②小心剪开腹部皮肤，用小镊子挑起腹膜，注入5ml无血清培养液，用镊子轻揉腹腔，将注入液体回抽，反复注入、抽吸2～3次。③将收集的细胞悬液注入50ml的 离心管 中，加20ml无血清培养液洗涤一次。④用含血清培养液（HAT）15～20ml调至4×105个细胞/ml，用吸管混匀后，接种到96孔板，每孔加0.1ml，置于37℃、5%CO2孵箱中。
（5）细胞融合（杂交） ：①分别吸取含107个骨髓瘤细胞和108个脾细胞悬液，加入50ml的离心管中，充分混匀，并加1640培养液至20ml，离心（1000 r／min，10min）。②弃上清，用手指轻击离心管底部，使沉淀混匀如糊状。然后置37℃水浴中。③取预热37℃的50% PEG 0.7ml，1min内在37℃水浴中边滴边摇动加入离心管中，使细胞保持在均匀状态。然后在37℃水浴中静置1.5min。④立即在2min内加37℃预温的RPMI 1640培养液15ml，以稀释PEG而失去的作用。开始要一滴一滴加，即可见细胞凝集成小块。操作宜轻柔，不损伤细胞，以免影响细胞融合。⑤以1000 r／min，离心7min，弃上清液，加25ml HAT培养液，轻轻混匀，滴加入含有巨噬细胞饲养液的96孔板中，每孔0.1ml。
3. 杂交瘤细胞的选择性培养
（1）培养：将融合后的细胞悬浮于HAT培养液中，置于含5%～7% CO2，37℃饱和湿度培养箱中培养。
（2）换液：每2～3天更换一半量的培养液一次，在融合两周内使用HAT培养液，在第12～13天用HT培养液，在第14天后根据细胞增殖情况改用15%～20%FCS完全培养液。
在停用A后，残留于培养液或细胞内的A仍起一定的阻抑作用，此时需继续补加HT培养液，为杂交瘤细胞提供应急的DNA合成途径。
