蛋白质分子量测定[凝胶层析法]

一、实验目的
1. 了解凝胶层析的原理及其应用。
2. 通过测定蛋白质分子量的训练，初步掌握凝胶层析技术。

二、实验原理
凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。它广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等，而测定蛋白质的分子量也是它的重要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近于球形）具有不同的排阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
凝胶层析分离原理示意图参见64页的“图 3－5”。
对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0～100%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示，Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（V _t ）、外水体积（V ₀ ）以及分离物本身的洗脱体积（V _e ）有关：
Kav = (V _e －V ₀ )/(V _t －V ₀ ) ----------- (1)
在限定的层析条件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是随着分离物分子量的变化而改变。分子量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小Ve值大，Kav值大。
65页的“图 3－6”画出了凝胶层析柱中凝胶自身（基质）体积（V _g ）、外水体积（V ₀ ）、内水体积（V _i ）及柱床总体积（V _t ）的示意图。
65页的“图 3－7”示出了凝胶层析柱中的几种层析峰。
有效分配系数Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分子量的一个依据。在相同层析条件下，被分离物质Kav值差异越大，分离效果越好。反之，分离效果差或根本不能分开。在实际的实验中，我们可以实测出V _t 、V ₀ 及V _e 的值，从而计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶，在一定的分子量范围内，Kav与logMw (Mw表示物质的分子量) 成线性关系：
Kav ＝－b logMw + C --------- (2)
其中 b,C为常数。

同样可以得到：
Ve ＝－b’logMw + C’ --------- (3)
其中 b’, C’为常数。即 Ve 与 logMw 也成线性关系。我们可以通过在一凝胶柱上分离多种已知分子量的蛋白质后，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后用同一凝胶柱测出其它未知蛋白的分子量。

三、器材与 试剂
（一）器材
1. 玻璃层析柱（(20mm×60cm）
2. 恒流泵（或下口恒压贮液瓶）
3. 自动部分收集器
4. 紫外分光光度计
5. 100ml 试剂 瓶
6. 1000ml量筒
7. 250ml烧杯
8. 50ml、100ml烧杯
9. 10ml（或5ml）刻度试管
（二）试剂
1. 标准蛋白
（1）牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所）
（2）鸡卵清清蛋白：Mw=45,000（美国SIGMA公司）
（3）胰凝乳蛋白酶原A：Mw=24,000（美国SIGMA公司）
（4）溶菌酶：Mw =14,300
2. 未知蛋白质样品：由实验室准备
3. 0.025M KCl－0.1M HAC(乙酸)（洗脱液1000ml）