超氧化物歧化酶(SOD)的检测方法

摘要：
SOD的催化使超氧自由基(O ₂ ^- )被破坏，并针对氧毒性筑起了第一道防线。SOD的活性及其检测技术与许多不同领域都息息相关，如医药、生化、植物生理、食品工程等。在过去的几十年中，人们已经发现了各种各样的SOD检测方法，但是，这些方法在选择性、检测速度、价格、简便程度上都存在各自的缺陷。最近，我们发现水溶性四唑盐如XTT，WST-1，WST-8适合用于O ₂ ^- 的检测并且也可以被用于SOD的检测。在这些四唑盐中，WST-1灵敏度高，氧化态的吸光度低，水溶性好，因此，最适合用来做SOD检测。这种用WST-1来检测SOD的方法可以被用于鼠红血球、心脏、肝脏等生化样品中。我们还发现了一种使用了WST-1的流式注射法检测SOD的检测系统，通过这个系统能够进行快速的检测（每小时可以检测30个样品）。

常用的几种SOD检测方法：
1.分光光度法
分光光度法是最为典型的检测SOD的方法，这种方法使用了细胞色素 C(cytochrome C)或者氮蓝四唑（NBT）（图1）。用cytochrome C的还原法来检测O ₂ ^- 是因为还原后的cytochrome C会生成紫色的染料（图解 2）。这是自SOD被发现以来最常用的方法
Cyt(FeⅢ) + O ₂ - —> Cyt(FeⅡ) + O ₂
因为cytochrome C很容易被NADPH还原酶或者其他的还原剂所还原，因此必须要考虑样品的污染因素。而且，这种方法需要每隔1.5分钟就要察看一下，因此不适合做大批量的实验。NBT法的原理是生成不溶于水的蓝色甲臢染料(max: 560 nm)去和O ₂ ^- 反应。这种染料不溶于水，在做长时程分析时会生成不均一的沉淀物，从而影响实验数据的重现性。为了得到水溶性的甲臢染料，许多改良后的方法如添加BSA被人们所采用。但是，添加了不必要的蛋白质会使数据分析变得十分复杂，而且NBT会被多种还原剂所还原。NBT的这种特性被用于酮胺的检测，酮胺可以作为糖尿病的标记物并且是Maillard反应的中间体。NBT法的最大缺点是即使加入过量的SOD也不能获得100%的抑制率，原因是NBT会与黄嘌呤氧化酶直接反应。

1． 化学发光法
用于O ₂ ^- 检测的化学发光探针同样也能用于SOD的检测，这种探针分为2种，一种是光泽精，另一种是荧光素衍生物（MCLA）。这种化学发光反应对pH有高度的依赖性。例如，光泽精只有在pH 9.0或者更高处会发出强烈的化学光。因此，在生理的pH条件下用这种方法检测SOD是不可行的。另一方面，MCLA在生理条件下能够发出较强的化学荧光，因此可以用于人脑的Cu,Zn-SOD活性的检测。但是，MCLA不适合用作SOD检测的探针，因为它不单单和O2-反应，还会和单质氧反应。而且MCLA与溶解氧反应后会发出化学光，转移的金属离子还会加速氧化反应。

3.电子自旋共振（ESR）光谱法
在室温下，溶液中O ₂ ^- 的ESR信号不能直接被检测出，但能够通过自旋捕捉法间接获得。最常见的诱捕剂是5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide(DMPO)。由于O ₂ ^- 诱捕DMPO会产生一个特殊的光谱图，因此ESR法是O ₂ ^- 检测的方法中特异性最好的一种。然而，DMPO与O ₂ ^- 间的二阶速度常数比O ₂ ^- 自发反应常数相对要低，因此需要向溶液中加入大量的DMPO（如：终浓度为0.45M）。这样，每次试验所要用的DMPO将花去大笔的经费。
这种方法的另一个问题是在实验中需要一套较为昂贵的ESR设备。

4．利用水溶性四唑盐检测SOD的新方法
为了克服上述的诸多问题，我们在做SOD检测时需要考虑如下几个方面：实验设备要简单、经济，pH灵敏度要低，对O ₂ ^- 有高度的特异性。如果用分光光度计作为一种简单的实验设备的话，就需要一种与cytochrome C和NBT相似的比色探针。检测中最重要的一点是在没有其他物质干扰的情况下，测定出SOD100%的抑制率。为了得到一种新的检测SOD的方法，我们对还原后能生成水溶性甲臢的四唑盐作了一系列的实验。

4．1 XTT
XTT是一种在1988年首次被报道的水溶性四唑盐，自从那时起，它就被用作细菌或者哺乳动物细胞电子转移系统的底物。它的结构如图1所示。NBT具有一个双四唑盐结构，而XTT的结构则为单四唑盐并且有两个璜酸基团。

图1. SOD检测中的四唑盐的结构

我们用XTT来检测SOD，如图2所示，随着SOD浓度的上升，可以观察到100%的抑制率。这种100%的抑制率在过去用NBT法时从没得到过。即使在不同的pH条件下，仍能观察到100%的抑制率。XTT的这种100%的抑制率意味着XTT只会被O ₂ ^- 特异地还原，XTT解决了NBT所不能解决的问题。

图2. 用NBT（●）和XTT（○）所得的SOD的抑制曲线