sod的检测方法

摘要：

SOD的催化使超氧自由基(O2-)被破坏，并针对氧毒性筑起了第一道防线。SOD的活性及其检测技术与许多不同领域都息息相关，如医药、生化、植物生理、食品工程等。在过去的几十年中，人们已经发现了各种各样的SOD检测方法，但是，这些方法在选择性、检测速度、价格、简便程度上都存在各自的缺陷。

最近，我们发现水溶性四唑盐如XTT，WST-1，WST-8适合用于O2-的检测并且也可以被用于SOD的检测。在这些四唑盐中，WST-1灵敏度高，氧化态的吸光度低，水溶性好，因此，最适合用来做SOD检测。

这种用WST-1来检测SOD的方法可以被用于鼠红血球、心脏、肝脏等生化样品中。我们还发现了一种使用了WST-1的流式注射法检测SOD的检测系统，通过这个系统能够进行快速的检测（每小时可以检测30个样品）。

常用的几种SOD检测方法：

1． 分光光度

分光光度法是最为典型的检测SOD的方法，这种方法使用了细胞色素 C(cytochrome C)或者氮蓝四唑（NBT）。用cytochrome C的还原法来检测O2-是因为还原后的cytochrome C会生成紫色的染料。这是自SOD被发现以来最常用的方法。

Cyt(FeⅢ) + O2- ―> Cyt(FeⅡ) + O2

因为cytochrome C很容易被NADPH还原酶或者其他的还原剂所还原，因此必须要考虑样品的污染因素。而且，这种方法需要每隔1.5分钟就要察看一下，因此不适合做大批量的实验。NBT法的原理是生成不溶于水的蓝色甲染料(lmax: 560 nm)去和O2-反应。

这种染料不溶于水，在做长时程分析时会生成不均一的沉淀物，从而影响实验数据的重现性。为了得到水溶性的甲染料，许多改良后的方法如添加BSA被人们所采用。但是，添加了不必要的蛋白质会使数据分析变得十分复杂，而且NBT会被多种还原剂所还原。

NBT的这种特性被用于酮胺的检测，酮胺可以作为糖尿病的标记物并且是Maillard反应的中间体。NBT法的最大缺点是即使加入过量的SOD也不能获得100%的抑制率，原因是NBT会与黄嘌呤氧化酶直接反应。

2． 化学发光法

用于O2-检测的化学发光探针同样也能用于SOD的检测，这种探针分为2种，一种是光泽精，另一种是荧光素衍生物（MCLA）。这种化学发光反应对pH有高度的依赖性。例如，光泽精只有在pH 9.0或者更高处会发出强烈的化学光。

因此，在生理的pH条件下用这种方法检测SOD是不可行的。另一方面，MCLA在生理条件下能够发出较强的化学荧光，因此可以用于人脑的Cu,Zn-SOD活性的检测。

但是，MCLA不适合用作SOD检测的探针，因为它不单单和O2-反应，还会和单质氧反应。而且MCLA与溶解氧反应后会发出化学光，转移的金属离子还会加速氧化反应。

3.电子自旋共振（ESR）光谱法

在室温下，溶液中O2-的ESR信号不能直接被检测出，但能够通过自旋捕捉法间接获得。最常见的诱捕剂是5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide(DMPO)。由于O2- 诱捕DMPO会产生一个特殊的光谱图，因此ESR法是O2-检测的方法中特异性最好的一种。

然而，DMPO与O2-间的二阶速度常数比O2-自发反应常数相对要低，因此需要向溶液中加入大量的DMPO（如：终浓度为0.45M）。这样，每次试验所要用的DMPO将花去大笔的经费。

这种方法的另一个问题是在实验中需要一套较为昂贵的ESR设备。

4．利用水溶性四唑盐检测SOD的新方法

为了克服上述的诸多问题，我们在做SOD检测时需要考虑如下几个方面：实验设备要简单、经济，pH灵敏度要低，对O2-有高度的特异性。如果用分光光度计作为一种简单的实验设备的话，就需要一种与cytochrome C和NBT相似的比色探针。

检测中最重要的一点是在没有其他物质干扰的情况下，测定出SOD100%的抑制率。为了得到一种新的检测SOD的方法，我们对还原后能生成水溶性甲的四唑盐作了一系列的实验。

4.1 XTT

XTT是一种在1988年首次被报道的水溶性四唑盐，自从那时起，它就被用作细菌或者哺乳动物细胞电子转移系统的底物。它的结构如图1所示。NBT具有一个双四唑盐结构，而XTT的结构则为单四唑盐并且有两个璜酸基团。

我们用XTT来检测SOD，如图2所示，随着SOD浓度的上升，可以观察到100%的抑制率。这种100%的抑制率在过去用NBT法时从没得到过。即使在不同的pH条件下，仍能观察到100%的抑制率。XTT的这种100%的抑制率意味着XTT只会被O2-特异地还原，XTT解决了NBT所不能解决的问题。

反应混合液包含2.5 ml 50 mM的碳酸盐缓冲液（B,pH 9.4;C,10.2）或者50 mM的磷酸缓冲液（A,pH8.0）以及3 mM 的EDTA,3 mM的黄嘌呤，56.1 mU/ml的黄嘌呤氧化酶各0.1 ml，0.75 mM的XTT或者NBT以及如横坐标所示浓度的SOD样品溶液。

在NBT法中，还需添加0.1 ml的BSA。NBT除了会和黄嘌呤氧化酶反应外还会和葡糖氧化酶反应。我们向含有葡糖氧化酶的葡糖氧化反应液中加入XTT和NBT,然后测量生成的甲。

即便是在不生成O2-的葡糖-葡糖氧化酶反应中，NBT还是被还原并生成了甲，但是XTT这一方面却没有OD值的增加。最初随着XTT浓度的增加OD值会有所上升，这是因为XTT四唑盐背景OD值所引起的。从这个结果看来，XTT似乎不会和氧化反应过程中所生成的一些酶的还原态有直接的干扰，XTT是一种适合用于SOD检测的探针。

试验混合液（2.8 ml）含有下列成分：50 mM glycine-NaOH(pH 9.5),0.1 mM葡萄糖，0.1 mM NBT(●)，0.1 mM XTT(△)或者0.2 mM XTT(○)。反应从加入葡糖氧化酶后开始。检测25℃下470nm处（XTT）和560nm处（NBT）的吸光度。为了测试XTT对实际样品的可行性，我们用XTT法检测了兔红血球的SOD活性，并和NBT法所得的数据进行比较。

从红血球中提取的SOD初提物按照常规的方法进行分离。XTT法与NBT法的相关系数为0.954。由XTT法所得的数值大约为NBT法所得数值的2倍，反应了这2种方法的敏感性的不同。接下来，我们用这种方法来检测食品样本中的SOSA。

众所周知，食品样本是由多种成份组成的复杂的混合物。红酒、绿茶、咖啡、可可这些样品可以被拿来用XTT检测SOSA，因为这些样品已被证实含有SOSA。如同预期的一样，未经稀释的食物样品的颜色会形成干扰，样品中的物质直接还原了XTT。

为了得到10%或者更少的吸光度的变化，茶、红酒、速溶咖啡、可可等需要在pH8下分别稀释100倍，10倍，50倍和10倍。每一种稀释后的样品溶液在每个稀释度上都有超过50%的抑制活性，因此可以证明XTT在检测食物样品中的SOSA时是有用的。

这些结果与用ESR所得出的数据是相一致的。从这些结果中我们可以得知XTT不仅可以用于生物样品的检测还可以用于食物样品的检测。

XTT克服了NBT所不能克服的许多问题，因此XTT看似为更合适的SOD检测法。但是，我们在用XTT法试验中，又遇到了几个新的问题。其中一个就是依赖于pH的灵敏度的变化。

由NBT法所得的数据在pH8～10.2之间都是较为稳定的，但是在用XTT法时，如果降低了pH值会引起试验灵敏度的降低。因此，XTT法在pH8的灵敏度比NBT法要小。另一个问题是XTT的水溶性，XTT的水溶性在2 mM左右，并且需要一个加热过程来制备最佳XTT溶液(0.75 mM)。

4.2 WST-1和WST-8

从1993年到1998年，Ishiyama博士和他的研究小组发现了好几种水溶性的四唑盐。由于这些四唑盐的水溶性为数十mM到数百mM，因此我们可以用它们来代替XTT进行SOD检测。在这个实验中，我们采用了WST-1和WST-8（其结构式如图1所示），WST-1和WST-8都是具有磺酸基的单四唑盐。首先，我们用标准的SOD来优化反应条件。

反应混合液包括2.5 ml磷酸缓冲液(A,pH8.0)或者50 mM碳酸盐缓冲液(B,pH 9.4;C,pH 10.2)以及0.1 ml 3 mM的EDTA，3 mM的黄嘌呤，58 mU/ml的黄嘌呤氧化酶，0.75 mM的WST，还有横坐标上所示浓度的SOD样品溶液。

WST-1和WST-8都显示了XTT法中出现的100%的抑制率，需要注意的是，在不同的pH下是否能得到几乎相同的IC50。这个结果显示了WST法可以解决在XTT和NBT法中所存在的问题，是检测SOD的理想的试剂。由于可以得到100%的抑制率，接下来我们就要用WST-1和WST-8来确定是否会像XTT试验中那样由葡糖-葡糖氧化酶反应生成甲。

试验条件与图3中所用的相同，试验混合液含有0.1 mM NBT(■)，0.2 mM WST-1(●)或者0.2 mM WST-8(○)。需要在25℃下检测438(WST-1)，460（WST-8）或者560nm(NBT)的吸光度。

如同预期的一样，没有因葡糖-葡糖氧化酶反应而生成甲。而且随着WST浓度的增加，背景OD值并没有增加。因此，WST能够在背景较低的条件下检测SOD的活性。为了比较WST的灵敏度，我们将WST法所得的IC50与用XTT法和NBT法所得的进行比较（表1）。

表1: pH 10.2下各种四唑盐所得的IC50的比较

四唑盐 IC50(ug/ml)

WST-1 0.22
WST-8 0.75
XTT 0.26
NBT 0.55

IC50的值是在pH 10.2下测出的，这些数值显示WST-1在这些四唑盐中检测SOD活性的灵敏度最高。由于WST-1的检测灵敏度最高，所以我们用它来检测鼠红血球的SOD活性并同XTT法检测出的数值进行比较。结果，WST-1和XTT法的结果线性相关，相关系数为0.968。（n=7）

最近，Winterbourn博士小组证实了WST-1在SOD活性检测中的用途并发明了一种微孔板方法来检测SOD的活性。这种微孔板法可以用来检测人的红血球，鼠肝和心脏组织匀浆，其检测结果与过去用其他方法所得的结果是十分一致的。

如此看来，WST-1在生物样品上的应用是十分广泛的。最近，我们正在研究其在植物组织和食品样本中的用途。

为了得到一个WST-1法的自动分析系统，我们使用了流式注射分析法（FIA）。

p, pump; IV, injection valve; D, detector

在该系统中，我们使用了黄嘌呤氧化酶固定受体来避免试验中外源酶的影响，使该系统既快速又经济。在一系列试验之后，我们同时在受体上固定过氧化氢酶并以次黄嘌呤作为底物来增加黄嘌呤氧化酶的稳定性。

实验前，我们预先制备了次黄嘌呤和WST-1的混合液，并将其与样品溶液按1：9的体积比混合，然后将20 μl该混合液注入受体。如果样品中不含SOD，那么WST-1的甲生成量达到最大值，并可以观察到最大吸收峰。如果样品溶液含有SOD，那么吸收峰会按照SOD的活性相应降低。

A, 0; B, 1; C, 2.5; D, 5; E, 10; F, 25; G, 50; H, 100; I, 250; J, 500ug/ml

SOD的抑制曲线可以由峰值的削减比率所得的抑制率来绘出。从抑制曲线可以看出，IC50为2.7ug/ml,绝对值为50 ng。该数值要比由批量法得到的20ng的值要大许多。

但是，FIA法能够让我们在一个小时内检测出超过30个样品，其检测速度可以说是相当快的。我们用该方法检测出了鼠红血球的SOD活性，并将其与NBT法所得的数据进行了比较。

这两种方法所得的数据是高度相关的，即便这是一种快速检测方法，其结果与其他方法所得的数据还是相当一致的。

结论：

我们已经描述了SOD检测的重要性以及几种测定方法，随着SOD的被发现，每年都会有各种各样的检测系统被发明。这个现状告诉我们目前还没有一个完全令人满意的检测方法。

我们所发现的SOD的检测方法（WST-1法）是一种克服了许多常用方法中的常见问题的，颇具吸引力的检测方法。为了将这种方法作为检测SOD的标准方法，我们计划调查作为O2-探针的WST-1的特异性。

本文译自：Assay of Enzyme Superoxide Dismutase (SOD)
作者： Hiroyuki UKEDA, Ph.D.
Department of Agriculture,Khochi University,200 Mononobe Otsu
Nangoku-city, Khochi 783-8502,,Japan