凝胶回收常见问题分析

未回收或回收率低

1. 胶块未全部溶解.溶解凝胶时应置于55℃水浴，不断上下颠倒，确定胶块完全溶解后再进行下一步骤。

2. 胶块太大（>400 mg）.如果需要处理的胶块太大，应先将其切成小块，做两次回收或选用大量型回收 试剂 盒。

3. 电泳缓冲液pH值太高.硅胶膜在高盐及低pH值（pH≤7.5）时可结合DNA，在低盐及高pH值（pH≥8）条件下洗脱。如果电泳缓冲液pH值太高，会导致DNA无法结合或降低结合率。可在溶胶后加入 10μl KAc（pH5.0），将pH值调至7.5以下。

4. 漂洗液中未加无水乙醇.第一次使用前应在漂洗液中加入无水乙醇。漂洗液每次用后应拧紧瓶盖，以免乙醇挥发，降低回收率。

5. 洗脱缓冲液不合适.DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB (10 mM Tris·Cl, pH8.5)或水。洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH 7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内。

6. 洗脱缓冲液未加在离心柱中间尤其使用较少量洗脱缓冲液时，应加在离心柱正中间，并放置1-2分钟，再离心。

7. 加入异丙醇后产生雾状和凝胶状沉淀。这种现象可能是盐沉淀，颠倒混合样品沉淀就会消失。 或者是胶块没有完全溶解，此时可将混合物加入离心柱，离心，在离心柱中再加入0.5 ml 溶胶液室温放置1min，离心即可出去剩余 琼脂 糖凝胶。


回收后的片段无法用于后续实验，如连接等

1. 洗出液中含乙醇。洗脱时硅胶膜或硅胶树脂上有漂洗缓冲液残留，会使洗脱产物中含有乙醇，影响下游操作。在洗脱前可通过再次离心或置于50℃烤箱中5-10分钟，彻底去除漂洗缓冲液。

2. 洗出液中污染有 琼脂 糖。凝胶未全部溶解。

3. 洗脱产物含有ssDNA，表现为在琼脂糖电泳上呈小弥散带。将洗脱产物95℃加热 2 min,慢慢冷却到室温，使单链DNA重新退火复性即可。