凝胶回收及PCR/DNA片段纯化常见问题分析及其解决方案

问题 可能原因 解决方案

回收率低膜结合液（MB）使用量不当按每1 mg凝胶或每1 µl DNA溶液加入1 µl膜结合液的比例（1:1）加入膜结合液溶胶不完全尽量将胶切成小块，加入膜结合溶液后于55～65℃加热助溶，确保溶胶彻底离心转速不够，溶液中的DNA没有与硅胶膜充分结合使用离心力≥12,000x g的离心机；

如达不到该转速，可通过适当延长离心时间确保胶溶液完全通过硅胶膜膜漂洗液（MW）未添加乙醇第一次使用时按比例添加乙醇，并在试剂瓶上做标记洗脱溶液pH值不合适使用试剂盒提供的洗脱缓冲液（EB）；

如用去离子水洗脱，需将pH值调至7.5~8.5范围洗脱溶液体积过小使用30 µl洗脱溶液，加至硅胶膜的中央，静置1分钟，使膜完全浸润后再离心回收产物测序结果不佳用量太低提高测序反应使用的DNA量；

如果回收产物浓度过低，可通过乙醇沉淀浓缩产物用量过高，干扰测序结果降低DNA用量，必要时用EB或灭菌双蒸水进行稀释TE缓冲液干扰测序结果使用无DNA酶污染的洗脱缓冲液（EB）或灭菌双蒸水溶解DNA作为测序模板紫外线下暴露时间过长切胶动作要快，尽量减少紫外线照射的时间酶切效果不佳酶的质量低劣或使用方法不当按照厂家说明书正确使用酶；

设立阳性对照检测内切酶活性膜漂洗液（MW）去除不彻底，胶回收产物中残留有乙醇或盐再次乙醇沉淀回收，并确保DNA溶液体积不高于酶切反应总体积的10％电泳上样时漂出上样孔未添加上样缓冲液与适量上样缓冲液混合后上样膜漂洗液（MW）去除不彻底；

胶回收产物中残留有乙醇确保洗涤步骤中洗涤缓冲液去除彻底，可增加离心时间或打开盖一段时间使残留乙醇挥发回收产物电泳条带不锐利DNA分子断裂切胶、混合等操作尽量小心，

特别是大片段，应避免DNA因机械损伤而断裂其他DNA分子污染DNA切胶回收时应使用新配制的琼脂糖胶和电泳缓冲液以避免DNA污染DNA分子降解切下来的胶块如不能及时回收，应于4℃保存，避免DNA降解克隆效率低离心吸附柱漂洗不彻底再次乙醇沉淀回收回收过程中有外切酶污染，导致DNA片段末端序列缺失用新鲜配制的胶和电泳缓冲液进行电泳；

胶回收保证无菌操作感受态细胞的效率差确保感受态制备和保存方法正确