PCR常见问题分析及解决方案
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PCR技术的发明
1983 Kary Mullis 发明
1985 开始有文章发表
1993 获诺贝尔奖
广泛用于分子生物学研究领域
变性--退火--延伸三个步骤
1、模板DNA的变性：93℃-95℃左右
2、模板DNA与引物的退火(复性)：Ta=Tm-3~5 ℃
3、引物的延伸：Taq DNA聚合酶之5’-3’DNA聚合酶活性
PCR标准反应体系
DNA模板
p引物
p反应缓冲液
pMg 2＋
pdNTP
p耐热聚合酶
pddH2O
反应体系对PCR扩增的影响
1、DNA模板:
纯度 蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应
完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物
浓度 浓度适当
2、引物
设计 长度适当、避免二级结构和二聚体
合成质量
浓度 50uL体系引物加量为10-20 pmol
3、反应Buffer
pH、盐离子、稳定剂、增强剂
提供缓冲环境
4、Mg 2＋浓度
过高非特异性严重
过低无扩增产物
5、dNTP Mixture
浓度适当，避免反复冻融
6、ddH2O
pH值适当，避免污染
如何选择最合适的DNA聚合酶
1、Taq酶——扩增效率最高发现
1969年，美国黄石国家公园温泉
活性
5‘-3’ DNA聚合酶活性 强
5‘-3’ DNA外切酶活性 弱 荧光探针（定量PCR方法）
3‘-5’ DNA外切酶活性 无 错配率每个循环约1/6000
3‘末端加“A” 能 产物可直接进行“TA”克隆
生产质检
诱导大肠杆菌表达、三次柱纯化，分离获得94kD重组蛋白。
无核酸酶和细菌DNA污染
能有效扩增人基因组单拷贝基因
室温放置一周，无明显活性改变
2.pfu酶——保真度高
原理
具3’－5’核酸外切酶活性，即校正功能。
效率相对较低
3‘末端不加“A”，加A后才可进行TA克隆。
用途
–表达基因的克隆
–基因的定点突变
–细胞内基因点突变分析（SNP）
3.HotStart Taq酶——特异性高
原 理
–蜡封
–抗体抑制
–化学修饰
提高PCR特异性，减少甚至避免非特异性扩增
3‘加“A”，可直接做“TA”克隆
用 途
–混杂模板
–半定量、定量PCR
4.混合酶——高扩增效率＋高保真度
Taq plus
Taq+pfu
用于复杂模板（GC rich, 二级结构）扩增
大多数情况下可替代Taq, 特别是产物在6Kb以上时，可扩10-20kb
Long Taq
Taq+pfu
超长片断扩增，15-40kb
Taq platinum
HotStart+pfu
高扩增效率＋高保真度
根据PCR实验的不同需求
基因组扩增、RT-PCR ——————— 特 异 性
基因突变、测序、 表达克隆————— 保 真 性
构建基因图谱、测序等—— 长片段扩增
复杂模板扩增 (GC含量高、二级结构) —扩增效率
PCR MasterMix
PCR Master Mix 产品特点
特 点
• 快速简便 减少加样误差和污染
• 灵敏度高 可扩增低至2个拷贝的目的模板
• 特异性强 降低PCR反应的要求，增强特异性
• 稳定性好 -20℃一年以上，反复冻融不影响活性
适用范围
• 大规模基因检测
• 目的基因拷贝数极低的样本
• GC含量高,有二级结构的模板
• 复杂基因组样本
PCR常见问题分析
PCR常见问题
1、无扩增产物
①无扩增产物之模板原因
②无扩增产物之引物原因
③无扩增产物之PCR条件原因
2、非特异性扩增或拖尾
现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带
3、假阳性
现象：空白对照出现目的扩增产物
提高PCR特异性的策略
四种策略
1、巢式PCR（Nest-PCR）
2、递减PCR（TouchDown PCR）
–前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性
–循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃
–特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势
–递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等
3、热启动PCR（HotStart PCR）
–热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度
–通常选择热启动Taq酶
–热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一
4、使用PCR增强剂
–甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等
–可能的机理：降低熔解温度，有助于引物退火，辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区
–增强剂浓度要适当
