十二 Western印迹鉴定目标蛋白

1.了解Western blot的原理及其意义，掌握Western blot的操作方法；
2.应用Western blot 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到尼龙膜上的重组蛋白。

Western印迹法简称蛋白质印迹法。蛋白质样品经 SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键的形式与蛋白质结合，从而固定住蛋白质；以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体起免疫反应，再和酶标记或同位素标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中温育，或通过放射自显影显出谱带，即可检测出样品中的特异蛋白组分。

(一) 试剂

1.转移缓冲液：2.9g 甘氨酸（39 mmol/L），5.8g Tris 碱（48mmol/L），0.37g SDS（0.037%），200ml 甲醇（20%），定容至1,000mL；
2.封闭液：5% 脱脂奶粉，0.02% 叠氮钠，溶于PBST溶液中；
3.丽春红S（Ponceaus）染液：0.5g 丽春红S溶于1mL 冰乙酸中，加水至100mL；
4.PBST洗膜液： PBS 缓冲液含0.5% Tween 20；
5．DAB浓缩显色液（50X）：DAB（二氨基联苯胺）是根过氧化物酶的底物之一，临用前稀释。
6．5 x PBS( 磷酸缓冲液 )：在1600mL 蒸馏 水中溶解82.3g Na 2HPO4 , 20.4g Na H2PO4, 40g Na Cl, 用0.1mol/L NaOH调pH至7.4，加水定容至2升。高压灭菌20 分钟，室温保存。用前稀释至1x 。
7．SDS-PAGE电泳用溶液和试剂。

(二)器材

1.SDS-PAGE电泳装置一套;
2.电转移膜装置
3.抗体-酶反应摇床

〈一〉电转移

1．将蛋白质样品进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑出胶后停止电泳（1）。
2．载手套切6-8张定性滤纸和一张尼龙膜，它们的大小应与凝胶的大小相同。在尼龙膜的一（左）角作一记号（或剪角），与滤纸和海棉（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中。
3．剥胶，并将凝胶裁成合适大小，切角以做记号（2）。
4．按下图示制备“夹心饼”，打开电极板，在一边放上一块纤维垫，再依次往上叠加3-4张滤纸，将凝胶轻放于滤纸上。再将一张NC膜放上，加上3-4张滤纸，每加上一种物品都要精确对齐，并确保没有气泡(3)。再铺上纤维垫，最后将电极板夹上，夹上夹子插进转膜槽中。

5．按上示意图，接上电源（凝胶一边接负极，尼龙膜一边接正极），恒流电泳1.5小时， 0.8mA/cm2 膜。
6．关闭电源，将尼龙膜取出，置塑料盒中用丽春红S染色约5分钟，回收丽春红S，然后用 蒸馏 水洗去背景染料显色，室温稍干燥后用铅笔描下 Marker所在位置，然后用PBST浸泡几次，完全洗去丽春红S染料（4）。

〈二〉封闭

7．将膜放入塑料盒中，加入20mL封闭液，置脱色摇床中缓慢摇动，室温1小时或4℃封闭过夜（5）。〈三〉靶蛋白与第一抗体结合
8 弃去封闭液，加入含有第一抗体的封闭液5～10mL，室温平缓摇动温育3小时。然后尽量回收抗体溶液，- 20℃ 保存，可重复使用（6）。
9．用PBST室温洗膜3次，每次10 min（7）。

〈四〉与第二抗体反应

10.弃去PBST溶液，加入适量（～5-10mL）含有第二抗体的封闭液，室温下平缓摇动温育1小时（8），尽量回收第二抗体。
11．用PBST溶液漂洗尼龙膜3次，每次10钟。

〈五〉显色

12．把尼龙膜置于稀释50倍的DAB溶液中，轻轻摇动，显色约10－30 min，待蛋白带的颜色深度达到要求后，用水漂洗，最后转移至PBS溶液中，拍照或扫描（9）。

（1）电泳时间要根据目标蛋白大小而定。
（2）为避免干燥，可在胶上滴转膜缓冲液或浸泡在转膜缓冲液中，使其离子强度和pH值与转膜缓冲液一致。
（3）可用一圆棒在滤纸上来回滚动以驱除气泡。
（4）染色后整张膜呈红色，由于丽春红S与膜上蛋白的结合很不紧密，因此脱背景色时要注意观察，勿将红色的蛋白带也洗去；脱色完毕，观察转移效果，并用铅笔在分子量标准带处做上记号。 如果用预染的Marker，则不需要用丽春红染色。
（5）封闭液的作用是封闭膜上没有蛋白带的部位，以减少抗体的非特异结合；我们推荐4℃封闭过夜。
（6）抗体的用量以浸没尼龙膜为准，用封闭液稀释第一抗体，抗体的稀释度要由预实验来定，下列数值可作为参考：多克隆抗体：1：100到1：5000 小鼠腹水：1：1000到1：10 000
（7）PBS对膜上的蛋白没有影响，但可洗去剩余的封闭液和其它杂质；Tween 20 是一种非离子型去污剂，含适当浓度Tween 20的PBST可洗去非特异结合的抗体，使整张膜的背景更清晰。
（8）一般所用的第二抗体（抗 免疫球蛋白 或蛋白质A）为酶标抗体，如辣根过氧化物酶标抗体或碱性 磷酸酶 标 抗体 。第二 抗体 的稀释度一般为：1：200到1：2000。本实验中第一抗体为鼠源单克隆抗体，因此二抗应选择兔抗鼠抗体，若一抗为兔源多克隆抗体，二抗应选择羊抗兔抗体。
（9）DAB有致突变之嫌，因此要戴手套操作；辣根过氧化物酶显色的条带在阳光下几个小时就会褪色，因此要尽快拍照。

试剂配制－电泳－转移：1天；
杂交－显色－结果处理：约1天。

1．用数码相机拍下丽春红S染色和最后抗体显色的结果，计算目标蛋白的分子量，并对结果加以分析。
2．对实验中出现的其它问题进行分析讨论。
3．进行凝胶电泳时应如何选择样品点样，设置对照？