酵母RNA的提制

一、目的：
学习和掌握从酵母中提制RNA 的原理和方法，从而加深对核酸性质的认识。
二、原理：
提取和制备RNA 的首要问题是选RNA 含量高的材料。微生物是工业上大量生产核酸的原料，其中RNA 的提制以酵母最为理想，因为酵母核酸中主要是RNA（2.67～10.0%），DNA 很少（0.03～0.516％），而且菌体容易收集，RNA 也易于分离。此外，抽提后的菌体蛋白质（占干菌体的50%）仍具有很高的应用价值。
RNA 提制过程首先要使RNA 从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去。再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质，将pH 调至2.0～2.5，使RNA 沉淀，进行离心收集。然后运用RNA 不溶于有机溶剂乙醇的特性，以乙醇洗涤RNA 沉淀。提取RNA 的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。稀碱法利用细胞壁在稀碱条件下溶解，使RNA 释放出来，这种方法提取时间短，但RNA 在稀碱条件下不稳定，容易被碱分解；浓盐法是在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的透性，使RNA 释放出来，此法易掌握，产品颜色较好。使用浓盐法提出RNA 时应注意掌握温度，避免在20～70℃之间停留时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用的温度范围，会使RNA 因降解而降低提取率。在90～100℃条件下加热可使蛋白质变性，破坏磷酸二酯酶和磷酸单酯酶，有利于RNA 的提取。
三、实验材料、主要 仪器 和试剂
1．实验材料
活性干酵母；pH0.5～5.0 的精密试纸；冰块。
2． 仪器
（1）药物天平
（2）三角瓶（100mL）
（3）量筒（50mL）
（4）水浴锅
（5）电炉
（6）试管木夹
（7）离心管
（8）离心机（4 000r/min）
（9）烧杯（250mL, 50mL, 10mL）
（10）滴管及玻棒
（11）吸滤瓶（500mL）
（12）布氏漏斗（60mm）
（13）表面皿（8cm）
（14）烘箱
（15）干燥器
（16）紫外可见分光光度计
3． 试剂
（1）NaCl（化学纯）
（2）6mol/L HCl
（3）95％乙醇（化学纯）
四、操作步骤
1．提取
活性干酵母粉5g，倒入100mL 三角瓶中，加NaCl 5g，水50mL，搅拌均匀，置于沸水浴中提取1h。
2．分离
将上述提取液取出，立即用自来水冷却，装入大 离心管 内，以3 500r/min 离心10min，使提取液与菌体残渣等分离。
3．沉淀RNA
将离心得到的上清液倾于50mL 烧杯中，并置于放有冰块的250mL 烧杯中冷却，待冷至10℃以下时，用6mol/L HCl 小心地调节pH 至2.0～2.5。随着pH 下降，溶液中白色沉淀逐渐增加，到等电点时沉淀量最多（注意严格控制pH）。调好后继续于冰水中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。
4．抽滤和洗涤
上述悬浮液以3 000r/min 离心10min，得到RNA 沉淀。将沉淀物放在10mL 小烧杯内，用95％的乙醇5～10mL 充分搅拌洗涤，然后在铺有已称重滤纸的布氏漏斗上用 真空泵 抽气过滤，再用95％乙醇5～10mL 淋洗3 次。由于RNA 不溶于乙醇，洗涤不仅可脱水，使沉淀物疏松，便于过滤、干燥，而且可除去可溶性的脂类及色素等杂质，提高了制品的纯度。
5．干燥
从布氏漏斗上取下有沉淀物的滤纸，放在8cm 表面皿上，置于80℃烘箱内干燥。将干燥后的RNA 制品称重。
6．含量测定
称取一定量干燥后的RNA 产品配制成浓度为10～50μg/mL 的溶液，在751 型 分光光度计 上测定其260nm 处的光密度值，按下式计算RNA 含量：

式中：OD260nm 为260nm 处的光密度值；L 为比色杯的光径（cm）；0.024 为1mL 溶液含有1μg RNA 的光密度值。
五、结果计算
根据含量测定的结果按下式计算提取率：

六、思考题
1．RNA 提制中注意事项是什么？
参考答案
1．主要注意事项为：避开 核酸酶 作用的温度范围20～70℃，防止RNA 降解。同时在调pH 值时，一定要缓慢小心，且要在低温下进行。此外，在抽滤洗涤时，要用乙醇洗涤，且不可用水洗，否则将导致RNA 部分溶解而造成损失，降低RNA 提取率。