RNAi技术及其在作物遗传育种中的应用

分子植物育种，2006 年，第4 卷，第6(S)期，第83-90 页
Molecular Plant Breeding, 2006, Vol.4, No.6(S), 83-90

卢东长城1,2 梁荣奇undefined
1 首都师范大学生命科学学院, 北京, 100037; 2 北京市农林科学院北京农业 生物 技术研究中心, 北京, 100097
~undefined 通讯作者, liangrq@hotmail.com
摘要Fire 等(1998)发现在线虫中双链RNA 可以有效地阻断同源基因的表达，并将这一现象称为RNA干扰(RNA interference, RNAi)，从而获得了2006 年的诺贝尔生理学/ 医学奖。RNA 干扰是指由双链RNA 引发的专一性沉默同源基因的现象，它可以专一性降解同源基因的mRNA 或修饰同源基因的启动子。目前有3 种转基因方法可以引起植物内源基因的RNA 沉默：产生双链RNA 转录本的反向重复RNAi (IR-RNA)、反义RNA (anti-sense RNA)技术和正义过量表达外源基因(sense RNA)。RNAi 技术作为一种下调表达技术，现在已经开始应用于许多作物的遗传改良以及外来病毒的基因沉默。本文综述了目前RNAi 技术在作物重要功能基因的鉴定、抗病毒作物的培育、降低有害物质含量或提高有益物质含量以改良作物品质、增加工业原料的含量等方面的研究进展。随着人们对作物代谢调控和RNAi 机制的进一步认识，RNAi 技术必将在作物遗传育种中得到更为广泛地应用。
关键词RNA 干扰, 遗传育种, 小干扰RNA, 功能基因组

RNAi and its Applications in Crop Genetics and Breeding
Lu Dongchangcheng1,2 Liang Rongqiundefined
1 College of Life Science, Capital Normal University, Beijing, 100037; 2 Beijing Agro-Biotech Research Center, Beijing Academy of Agricultural and
Forestry Science, Beijing, 100097
~undefinedCorresponding author, liangrq@hotmail.com
Abstr act Fire found that double-stranded RNA could very successfully suppress the expression of a homological
gene in 1998, and this phenomenon was termed RNA interference (RNAi). RNAi is a homology-dependent gene silencing phenomena that is triggered by the presence of a double-stranded RNA directed against mRNA of a gene or
the promoter region of a gene. There are three types of transgenes that can trigger the RNA silencing of endogenous plant genes: inverted repeat RNA interference, antisense-RNA technology and sense over-expression transgenes. This technology, as a knockdown technology, has been applied to a wide range of species to silence the expression of both specific genes and genes of invading viruses for crop genetics breeding. The advances of its application in gene function, virus resistance, the improvement of crop traits by decreasing disproducts content or increasing desire products content, and the benefit to industry in crop genetics and breeding were reviewed in this paper. Learning more about metabolic regulation of crop and RNAi mechanism, researchers would make RNAi more widely available for crop genetics breeding.
Keywords RNAi, Crop genetic breeding, siRNA, Functional genome

为了克服传统育种方法的局限，利用遗传工程技术引入基因获得新性状、或者消除基因去掉坏性状，已经广泛地、成功地应用于植物遗传改良和育种中。近年来，转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)已广泛地用于下调(down-regulate) 植物代谢过程中的某些关键酶。PTGS 发生在细胞质中，基因能够转录产生mRNA，但mRNA 在细胞质中被特异性地降解。
最近，植物RNA 干扰(RNA interference, RNAi) 技术已经用于高效、特异地沉默特定的植物基因(Smith et al., 2000; Kusaba, 2004; Jones, 2005)。RNAi 被Science 杂志评为2001、2002 年度自然科学10 大突破之一，是目前分子 生物 学和遗传学研究热点。 Fire 和Mello 因在RNAi 研究中做出了开创性工作而获得了2006 年的诺贝尔生理学/ 医学奖。RNAi 技术已经成为功能基因组研究、基因工程和生物医学的重要研究方法之一。

1 RNAi 的机理和分类
1.1 RNAi 的发现
Napoli 等(1990)将由强启动子控制的色素基因 CHS(查尔酮合酶)导入矮牵牛，以加深花的紫色，结果发现许多花瓣颜色并未加深，反而呈杂色甚至白色。他们把这一现象称之为共抑制(cosuppresion)，用以定义所转入外源基因和同源内源性基因的表达同时减弱的现象。随后，Guo 和Kemphues (1995)在线虫的par- 1 基因研究中，发现正义RNA 和反义RNA 都可以抑制基因的功能。
Fire 等(1998)研究证明，在正义RNA 阻断基因表达试验中，真正起作用的是双链RNA，而这些双链RNA 是体外转录正义RNA 时生成的，并将这一现象称为RNA interference。在后来的实验中，人们在植物(Vaucheret et al., 1998; Waterhouse et al., 2001; Baulcombe, 1999)、真菌(Cogoni and Macino, 1997)、涡虫(Sánchez-Alvarado and Newmark, 1999)、果蝇(Kennerdell and Carthew, 1998)、小鼠(Wianny and Zernicka-Goetz, 2000) 等多种生物中发现了 RNAi 现象，所以认为，RNAi 是真核生物中普遍存在的现象，RNAi 是生物进化过程中比较保守的机制。
1.2 RNAi 的作用机理
RNAi 在两个不同的水平上起作用：一是在转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)，其特点是基因能够转录出mRNA，但mRNA 被迅速地降解，从而失去功能；二是转录基因沉默(transcriptional gene silencing, TGS), 相应基因座上的 DNA 和组蛋白发生甲基化修饰，改变DNA 或染色质的结构，从而抑制基因的转录。共抑制现象通常和 PTGS 和TGS 两个水平相关(Kusaba, 2004)。
stranded RNA, dsRNA) 相关。RNA 依赖的RNA 聚合酶 (RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)可识别异常RNA (病毒RNA、细胞内异常表达的RNA) 并以之为模板合成dsRNA。细胞中的RNase Ⅲ家族成员将dsRNA 结合降解成21~23nt 的小干扰RNA (small interference RNA, siRNA)。在果蝇中，这种 RNase Ⅲ被称为Dicer 酶。siRNA 解螺旋，其中一条链(一般偏好于反义链) 进入RNA 诱导沉默复合体 (RNA-induced silencing complex, RISC)。siRNA 的反义链随即与mRNA 杂交，引导RISC 在其附近对 mRNA 进行切割。siRNA 也可能被装配到RNA 诱导转录沉默复合体(RNA-induced transcriptional silencing complex, RITS)，进而引起包括DNA 和组蛋白甲基化在内的染色质沉默(Verdel et al., 2004)。
1.3 RNAi 技术分类
RNAi 技术， 就是将体外合成的dsRNA (19~23bp)导入生物体，或者经过适当构建的在生物体内能表达形成dsRNA 的特殊结构载体导入生物体，引起内源同源基因的表达抑制。与传统的理化诱变、T-DNA 插入突变等方法相比，RNAi 技术具有以下优越性(Hannon, 2004; 黄冰艳, 2004)：①特异性：序列特异性的RNA 及其蛋白质功能丧失或降低，从而无需大量筛选、鉴定和分离突变植株；②高效性：少量dsRNA 就能导致内源基因几乎100%的沉默；③多效性：通过仔细地选择靶基因序列片段(植物RNAi 一般为600~1 000bp)，可选择性沉默某一基因家族中的单个基因、部分甚至全部家族基因的表达；④可选择性：通过采用不同的启动子，如诱导型、组织特异型，来抑制某一发育阶段、某一器官的基因表达。有3 种转基因方法可以引起植物内源基因的 RNA 沉默：产生双链RNA (dsRNA)转录本的反向重复转基因(inverted repeat RNA interference, IR-RNAi)，反义RNA 技术(anti-sense RNA)和正义过量表达外源基因(又称Sense-RNAi) (表1)。
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