分子标记在遗传育种中的应用

一、分子图谱的构建

分子图谱为植物基因，QTL的鉴别和定位、种质资源鉴定、物种进化等研究提供了有利的研究手段。主要包括以下步骤：根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合，建立作图群体；群体中不同植株或品系的标记基因型分析；标记间的连锁关系。

二、品种、品系鉴定和杂交种纯度分析

指纹图谱是鉴别品种、品系的有利工具，具有快速、准确等优点。在市场经济的条件下，指纹图谱在检测良种质量（真伪、纯度），防止伪劣种子流入市场，保护名、优、特种质及育成品种的知识产权和育种家的权益等方面均有重要意义。在国外，指纹图谱用来鉴定作物品种的DUS（Distinctness，Unformity， Stability），为品种审定、保存、保护提供依据。

指纹图谱要求：分辨率高，多态性强；重复性好，稳定可靠。亲缘关系分析可为品种、品系的鉴定提供指导，从中选出能区别大多数品种的标记。Weising（1992）发现微卫星DNA （GATA）4是一个多态性好，稳定性强的探针，用该探针可以检测出15个栽培番茄品种差异。

三、亲缘关系分析

DNA 标记所检测的是作物DNA 水平的差异，因而非常稳定，在分子图谱帮助下对品种之间的比较可覆盖，大大提高了结果的可靠性。可用于品种资源的鉴定与保存，研究作物的起源与发展进化，杂交亲本的选择等。利用分子标记可以确定亲本之间的遗传差异和亲缘关系，从而确定亲本间遗传距离，指导杂交育种亲本选配，减少杂交组合数，有效划分杂种优势群，为提高育种效率提供依据。

通过亲缘关系分析，可以纠正形态分类中一些不恰当的结论以及目前育种工作中存在的一些问题。孟祥栋通过对洋葱、胡葱、大葱的RAPD遗传分析，否定了“胡葱亲缘关系与大葱相近”的观点，而发现胡葱与洋葱亲缘关系较近，并推断胡葱可能是洋葱与大葱杂交后代逐渐进化而来的。张海英通过RAPD分析，发现生产上推广品种由于长期的定向遗传改良，遗传基础已非常狭窄，指出了目前黄瓜育种存在的问题。

四、基因标记及标记辅助育种（Marker-assisted Selection，MAS）

许多性状重要农艺性状表现为质量遗传特点，如抗病、抗虫、雄性不育、自交不亲和性等。质量性状虽然受少数主基因控制，但其中的许多性状仍受遗传背景、微效基因及环境因素影响，表现为数量性状特点。此外，某些病害的发病条件很难创造，某些病害为检疫对象，不允许引进，多种病害接种时可能产生拮抗作用，所有这些都给表型选择造成了困难。

利用与目标性状紧密连锁的分子标记，是进行质量性状选择的有效途径。标记目标性状的方法主要有两个：

（一）Young等人提出近等基因系法（Near-isogenic Lines，NILs）它是通过杂交及多代回交或自交分离而获得的（一般6-8代），除了目标基因外，控制其它性状的位点同轮回亲本（RP）基本一致，该系与原来的轮回亲本就构成了一对近等基因系。检测NIL与RP分子标记多态性的机会取决于回交供体亲本DP和轮回亲本RP的遗传距离，以及NILs中来自供体亲本染色体片段的大小。一般来讲，若DP和RP分属栽培种和野生种，检测到多态性的机率较大，转移的供体亲本的染色体片段较大，则越易检测到多态性分子标记。但回交转移的染色体片段过大则容易导致标记与目标基因连锁程度的降低，以致于出现“假阳性”。NILs的获得需要很长的时间, 至少要回交6代以上。而且会导致一些重要基因的丢失而限制了它的应用。　

（二）Michelmore等人（1991）提出了混合群体分组分析法（Bulked Segregant Analysis，BSA）。该方法将F2或BCF1分离群体中研究的目的性状，根据其表型（如感病和抗病）分为两组，分别提取两组单株的DNA ，等量混合，并用作模板进行标记分析。如果某一引物扩增的两个群体的DNA 表现出多态性，则表明该多态性片段与目标性状基因连锁，然后用筛选出的有连锁关系的几个引物对分离群体的单株DNA 进行扩增，找出更紧密连锁的分子标记。利用BSA法不需创造近等基因系，利用F2或BC1的分离群体即可完成标记，简单易行，目前在辅助选择研究中占据了重要位置,其前景也非常广阔。利用与目标性状基因紧密连锁的分子标记是进行质量性状选择的有效途径。NILs与BSA的结合运用，加速了与目的基因紧密连锁标记的建立与鉴定。

MAS的第一个应用的是有利基因的转育。为改善品种的某一性状，常用的方法是以此品种作轮回亲本，以具有目的性状的另一品种为供体，多次回交将目的基因从供体亲本转入轮回亲本。然而，在回交育种过程中，随着目的基因的导入，与目的基因连锁的不利基因也随之导入成为连锁累赘。利用与目的基因紧密连锁的DNA 标记，可以直接选择在目的基因附近发生重组的个体，从而避免或显著减少连锁累赘，提高选择效率。

MAS的另一个应用是有利基因累加。蔬菜中许多基因的表型是相同的，在这种情况下，经典遗传育种研究就无法区别不同基因，因而就无法鉴定一个性状的产生是由于一个基因还是多个具有相同表型的基因共同作用。采用分子标记的方法，先在不同亲本中将基因定位，然后通过杂交或回交将不同的基因转移到一个品种中。通过检测与不同基因连锁的标记判断一个个体是否含有某一基因，以辅助选择，即将表型的检测转换成基因型的检测。

标记辅助选择育种已开始在育种中应用。Chen（2001）利用与水稻抗白叶枯病基因Хa21连锁的标记辅助选择，通过3代回交、1代自交成功地将Хa21基因导入恢复系6087中，6087（Хa21）与轮回亲本相似性达到98.8％。然而迄今为止，辅助育种成功应用的例子仍较少。

五、数量性状因位点（QTL）的分子标记辅助选择

大多数重要的农艺性状均表现数量性状的遗传特点，如产量性状、成熟期、品质、抗旱性等。数量性状易受环境条件的影响，因此选择效果不好。传统育种方法周期长，主要是由数量性状造成的。近年来，由于分子标记技术的发展，人们已可将复杂的数量性状进行分解，象研究质量性状经验基因一样对控制数量性状的多个基因进行研究。QTL是在高密度的遗传图谱基础上，通过一定实验设计，获得分子标记，借助Mapmarker软件分析确定控制某一性状的基因在染色体上的位置。

当目标性状由少数几个基因控制时用标记选择，对发掘遗传潜力非常有效。然而,，当目标性质由多个基因控制时（如产量）， 由于需要选择的世代较多，加剧了标记与QTL位点重组，降低了标记选择的效果。在番茄上已获得与抗冷、抗盐、果型、果大小、糖分含量、果重等的QTL，涉及121个座位。