RNAi在植物中的应用

RNA沉默是广泛存在于生物中的一种古老现象，是生物抵抗异常DNA的一种保护机制,同时在生物生长发育过程中扮演着基因表达调控的角色。文章对RNA沉默研究中的几个热点问题进行了介绍，按RNA沉默持续时间的不同对其在植物中应用的方法进行了分析，并重点论述了RNA沉默在植物功能基因组研究、作物品质改良以及抗病毒植物培育等方面的应用及其发展前景。

RNA沉默(RNAsilencing)是一种结合和降解特异mRNA序列的形式,其发现可追溯到1990年，Napoli等]向矮牵牛中导入更多拷贝与粉红色色素合成有关的基因以产生颜色更深的紫色矮牵牛花，结果许多花朵的颜色不但没有加深，反而变成白色或花白色。因为导入的基因和其同源的内源基因同时都被抑制，所以被称为共抑制(co-suppression)现象。另外，这种共抑制现象被确认是发生在转录后水平，所以又被称为转录后基因沉默(post-transcrip-tionalgenesilencing，PTGS)。随后发现在真菌中的消除(quelling)现象以及动物的RNA干扰(RNAinterference，RNAi)现象都属于RNA沉默。另外，Makarova等在最近的研究发现，在原核生物中同样存在着类似真核生物的RNA沉默机制。

RNA沉默自发现以来,迅速的成为生物学研究的热点。不论对其机制的研究还是作为一种基因表达抑制技术的应用，RNA沉默都取得了巨大的成功。本文简要介绍了RNA沉默的产生机制及植物RNA沉默的特异性、RNA沉默的技术特点及其与RNA介导的DNA甲基化的关系等研究热点，并系统论述了RNA沉默技术在植物中的应用。本文还对RNA沉默技术的操作技术和应用领域进行了阐述，并对RNA沉默的在植物中的应用前景进行了展望。

1 RNA沉默研究中的几个热点问题

1.1RNA沉默的产生及其基本机制

RNA沉默是存在于生物中的一种古老现象，是生物抵抗异常DNA(病毒、转座因子和某些高重复的基因组序列)的保护机制，同时在生物发育过程中扮演着基因表达调控的角色，它可以通过降解RNA、抑制翻译或修饰染色体等方式发挥作用。RNA沉默存在两种既有联系又有区别的途径：siRNA(smallinterferenceRNA)途径和miRNA(microRNA)途径。siRNA途径是由dsRNA(double-strandedRNA)引发的，dsRNA被一种RNaseⅢ家族的内切核酸酶(RNA-inducedsilencingcomplex，Dicer)切割成21~26nt长的siRNA，通过siRNA指导形成RISC蛋白复合物(RNA-inducedsilencingcomplex)降解与siRNA序列互补的mRNA而引发RNA沉默。而miRNA途径中miRNA是含量丰富的不编码小RNA(21~24个核苷酸)，由Dicer酶切割内源性表达的短发夹结构RNA(hairpinRNA,hpRNA)形成。miRNA同样可以与蛋白因子形成RISC蛋白复合物，可以结合并切割特异的mRNA而引发RNA沉默。尽管引发沉默的来源不同，但siRNA和miRNA都参与构成结构相似的RISC，在作用方式上二者有很大的相似性。

1.2RNA沉默在植物与其他生物中的差异

尽管不同生物的RNA沉默机制相似，但植物与其他生物相比有其特异性。首先,在植物中存在系统性沉默(systematicRNAsilencing)现象，RNA沉默不会局限于单个细胞内，可以在细胞与细胞之间、甚至由诱导部位向更远的组织传播。其次，植物中存在转移性沉默(transitiveRNAi)，对于转基因植物中的外源基因，如果dsRNA诱导的RNA沉默区域对应于基因的中间区域，能检测到与其侧翼区段对应的siRNA。但内源基因却缺乏转移性沉默，表现出沉默区域的保守性]。这两种现象在线虫中也有发现,但在哺乳动物和昆虫中却没有发现类似的现象。最后，植物中的RNA沉默跟两种不同大小的siRNA有关：21nt和24ntsiRNA，21nt由RISC指导切割目的mRNA，而24nt则引发了系统性沉默和甲基化；而在动物中仅发现21nt的siRNA。

1.3RNA沉默与其他基因表达抑制技术的比较

RNA沉默属于一种基因表达抑制技术，能够使基因的表达受到抑制甚至完全不表达。基因表达抑制技术从作用机理上可分为DNA水平上的抑制(基因打靶、转座子标签和T-DNA插入等)、转录水平上的抑制(调控区甲基化等)和转录后水平上的抑制(反义RNA和RNA沉默等)。在基因功能研究中，RNA沉默与其他几种基因表达抑制技术相比有明显的优越性。首先，它比反义RNA技术效率更高，能在低于反义RNA几个数量级的浓度下使目标基因表达降到极低的水平甚至完全“剔除”，因此更容易产生功能降低甚至缺失的突变；其次，与T-DNA和转座子标签技术相比，不存在插入位点随机性的问题，理论上任何基因都可被针对性的dsRNA特异性沉默；最后，应用同源重组进行的基因敲除效率非常低，且打靶载体构建所需的同源序列较长，而RNA沉默高效并且需要的同源序列则较短。Wesley等[利用hpRNA载体产生的RNA沉默，98bp长的同源序列即可产生有效地RNA沉默。

1.4RNA沉默与RNA介导DNA甲基化

植物中，dsRNA不仅诱导RNA沉默的产生，而且还可以诱导产生序列特异性的DNA甲基化(RNA-directedDNAmethylation,RdDM)。针对启动子区域设计的dsRNA产生了启动子甲基化，这导致染色体构象的变化并影响了转录因子结合启动子的能力使转录效率降低。dsRNA被降解为长约23nt的siRNA揭示了它进入了一条跟PTGS中的dsRNA同样的途径。RdDM是一个非常特殊的过程，甲基化主要局限于RNA-DNA序列相同的部分，很少向临近序列扩散,这一种显著的特异性揭示了RNA-DNA碱基配对为甲基化提供了基础。RdDM也是一个精细的过程，能够使DNA产生甲基化的RNA长度约为30nt。RdDM产生了一个不寻常的甲基化模式：在保守的CG区和其他序列胞嘧啶也被甲基化。