RNAi在植物中的应用

RNA沉默是广泛存在于生物中的一种古老现象，是生物抵抗异常DNA的一种保护机制,同时在生物生长发育过程中扮演着基因表达调控的角色。文章对RNA沉默研究中的几个热点问题进行了介绍，按RNA沉默持续时间的不同对其在植物中应用的方法进行了分析，并重点论述了RNA沉默在植物功能基因组研究、作物品质改良以及抗病毒植物培育等方面的应用及其发展前景。

RNA沉默(RNAsilencing)是一种结合和降解特异mRNA序列的形式,其发现可追溯到1990年，Napoli等]向矮牵牛中导入更多拷贝与粉红色色素合成有关的基因以产生颜色更深的紫色矮牵牛花，结果许多花朵的颜色不但没有加深，反而变成白色或花白色。因为导入的基因和其同源的内源基因同时都被抑制，所以被称为共抑制(co-suppression)现象。另外，这种共抑制现象被确认是发生在转录后水平，所以又被称为转录后基因沉默(post-transcrip-tionalgenesilencing，PTGS)。随后发现在真菌中的消除(quelling)现象以及动物的RNA干扰(RNAinterference，RNAi)现象都属于RNA沉默。另外，Makarova等在最近的研究发现，在原核生物中同样存在着类似真核生物的RNA沉默机制。

RNA沉默自发现以来,迅速的成为生物学研究的热点。不论对其机制的研究还是作为一种基因表达抑制技术的应用，RNA沉默都取得了巨大的成功。本文简要介绍了RNA沉默的产生机制及植物RNA沉默的特异性、RNA沉默的技术特点及其与RNA介导的DNA甲基化的关系等研究热点，并系统论述了RNA沉默技术在植物中的应用。本文还对RNA沉默技术的操作技术和应用领域进行了阐述，并对RNA沉默的在植物中的应用前景进行了展望。

1 RNA沉默研究中的几个热点问题

1.1RNA沉默的产生及其基本机制

RNA沉默是存在于生物中的一种古老现象，是生物抵抗异常DNA(病毒、转座因子和某些高重复的基因组序列)的保护机制，同时在生物发育过程中扮演着基因表达调控的角色，它可以通过降解RNA、抑制翻译或修饰染色体等方式发挥作用。RNA沉默存在两种既有联系又有区别的途径：siRNA(smallinterferenceRNA)途径和miRNA(microRNA)途径。siRNA途径是由dsRNA(double-strandedRNA)引发的，dsRNA被一种RNaseⅢ家族的内切核酸酶(RNA-inducedsilencingcomplex，Dicer)切割成21~26nt长的siRNA，通过siRNA指导形成RISC蛋白复合物(RNA-inducedsilencingcomplex)降解与siRNA序列互补的mRNA而引发RNA沉默。而miRNA途径中miRNA是含量丰富的不编码小RNA(21~24个核苷酸)，由Dicer酶切割内源性表达的短发夹结构RNA(hairpinRNA,hpRNA)形成。miRNA同样可以与蛋白因子形成RISC蛋白复合物，可以结合并切割特异的mRNA而引发RNA沉默。尽管引发沉默的来源不同，但siRNA和miRNA都参与构成结构相似的RISC，在作用方式上二者有很大的相似性。

1.2RNA沉默在植物与其他生物中的差异

尽管不同生物的RNA沉默机制相似，但植物与其他生物相比有其特异性。首先,在植物中存在系统性沉默(systematicRNAsilencing)现象，RNA沉默不会局限于单个细胞内，可以在细胞与细胞之间、甚至由诱导部位向更远的组织传播。其次，植物中存在转移性沉默(transitiveRNAi)，对于转基因植物中的外源基因，如果dsRNA诱导的RNA沉默区域对应于基因的中间区域，能检测到与其侧翼区段对应的siRNA。但内源基因却缺乏转移性沉默，表现出沉默区域的保守性]。这两种现象在线虫中也有发现,但在哺乳动物和昆虫中却没有发现类似的现象。最后，植物中的RNA沉默跟两种不同大小的siRNA有关：21nt和24ntsiRNA，21nt由RISC指导切割目的mRNA，而24nt则引发了系统性沉默和甲基化；而在动物中仅发现21nt的siRNA。

1.3RNA沉默与其他基因表达抑制技术的比较

RNA沉默属于一种基因表达抑制技术，能够使基因的表达受到抑制甚至完全不表达。基因表达抑制技术从作用机理上可分为DNA水平上的抑制(基因打靶、转座子标签和T-DNA插入等)、转录水平上的抑制(调控区甲基化等)和转录后水平上的抑制(反义RNA和RNA沉默等)。在基因功能研究中，RNA沉默与其他几种基因表达抑制技术相比有明显的优越性。首先，它比反义RNA技术效率更高，能在低于反义RNA几个数量级的浓度下使目标基因表达降到极低的水平甚至完全“剔除”，因此更容易产生功能降低甚至缺失的突变；其次，与T-DNA和转座子标签技术相比，不存在插入位点随机性的问题，理论上任何基因都可被针对性的dsRNA特异性沉默；最后，应用同源重组进行的基因敲除效率非常低，且打靶载体构建所需的同源序列较长，而RNA沉默高效并且需要的同源序列则较短。Wesley等[利用hpRNA载体产生的RNA沉默，98bp长的同源序列即可产生有效地RNA沉默。

1.4RNA沉默与RNA介导DNA甲基化

植物中，dsRNA不仅诱导RNA沉默的产生，而且还可以诱导产生序列特异性的DNA甲基化(RNA-directedDNAmethylation,RdDM)。针对启动子区域设计的dsRNA产生了启动子甲基化，这导致染色体构象的变化并影响了转录因子结合启动子的能力使转录效率降低。dsRNA被降解为长约23nt的siRNA揭示了它进入了一条跟PTGS中的dsRNA同样的途径。RdDM是一个非常特殊的过程，甲基化主要局限于RNA-DNA序列相同的部分，很少向临近序列扩散,这一种显著的特异性揭示了RNA-DNA碱基配对为甲基化提供了基础。RdDM也是一个精细的过程，能够使DNA产生甲基化的RNA长度约为30nt。RdDM产生了一个不寻常的甲基化模式：在保守的CG区和其他序列胞嘧啶也被甲基化。

2 RNA沉默在植物中应用的方法

目前RNA沉默的应用在动植物中采用的方法差异较大，在动物中由于长链的dsRNA诱导PKR途径非特异性降解dsRNA[，因此动物研究一般采用siRNA的方式产生基因沉默；而在植物中由于细胞壁的限制，使注射、饲喂等方法将siRNA导入植物细胞内非常困难，因此植物中普遍采取dsRNA的方式产生RNA沉默。常用的RNA沉默技术按引起RNA沉默持续时间的不同可分为瞬时性的RNA沉默和持久的RNA沉默。

2.1瞬时性的RNA沉默

导致产生瞬时性RNA沉默的方法包括基因枪轰击法和病毒侵染法。基因枪轰击法是利用金弹或钨弹颗粒包裹设计好的DNA或载体来轰击目标植物组织获得RNA沉默的方法，尽管基因枪法也能产生持久性的转基因效应，但在RNA沉默中它更多的应用于瞬时性的RNA沉默研究。用该方法对植物的转化速度快，并且当DNA进入目标组织后就会被释放并迅速表达dsRNA而产生RNA沉默现象。Schweizer等通过基因枪轰击谷物如小麦、玉米和大麦的叶片表皮细胞将表达dsRNA或hpRNA的DNA结构转化入植物并引发RNA沉默，这种方法已经在沉默内源基因A1、MLO、GUS基因中得到证实,表现为目标基因活性的降低。Klahre等发现通过用携带dsRNA、siRNA和一个表达单链GFP基因RNA的质粒载体的微弹颗粒轰击转GFP基因烟草能够沉默GFP基因的表达。在转GUS基因烟草中通过基因枪介导的dsRNA、siRNA和正义、反义RNA轰击以使GUS抑制蛋白沉默，发现每种方法都能产生siRNA而导致GUS抑制蛋白的沉默,结果使GUS能正常表达。

病毒诱导的基因沉默(virusinducedgenesilencing,VIGS)是通过改造侵染植物的病毒使其携带用于产生RNA沉默的DNA序列，当用该病毒侵染植物时则产生RNA沉默现象。Kumagal等将人工构建的植物基因PDS的片段插入烟草花叶病毒基因组中使其产生包含正向或反向PDS序列片段的RNA时产生了光褪色现象,揭示内源的PDS基因被沉默。利用马铃薯X病毒和烟草rattle病毒发展了一种高效、精确的病毒诱导的基因沉默系统。尽管很多病毒诱导的基因沉默系统往往利用RNA病毒，但许多通过在终止子处发生通读而表达dsRNA的DNA病毒也被开发并被证明能够有效地产生RNA沉默现象。

通常进行VIGS时利用目的基因的300~800bp片段可达到很好的沉默效果，但片段长度在23~60bp时也被证实是有效的。利用不同的VIGS载体对于报告基因GUS或GFP或内源的PDS基因都得到很好的沉默效果。而利用TRV-VIGS载体报道了大量内源基因的沉默、尤其在抗病性和乙烯信号途径中的发挥作用的基因。并且TRV病毒对几乎所有的植物组织具有较好的侵染能力，这些因素使TRV-VIGS载体拥有更大的潜在发展空间。

2.2持久性的RNA沉默

目前,在植物中持久表达RNA沉默通常采用构建表达载体,通过PEG介导、电穿孔介导、农杆菌侵染等方法使设计的序列整合到植物基因组中并稳定表达。由于农杆菌侵染法技术的成熟,在持久性的RNA沉默研究中得到了广泛应用。对于RNA沉默的持久性，Stoutjesdijk等报道拟南芥中到T5代时RNA沉默仍然是遗传稳定性的。构建hpRNA高效表达载体用于特定基因沉默是研究的热点之一。Wesley等系统研究了不同结构的RNA对沉默效率的影响，发现相比于单链正义或反义RNA，双链RNA尤其是发夹式结构的RNA(hpRNA)对RNA沉默的效率有非常显著的提高。如果在发夹结构的反向重复序列间加入一段非编码序列如内含子，在植物体内转录形成含内含子的发卡结构(intronsplicinghpRNA，ihpRNA),则沉默效果与hpRNA相比可从58%提高到90%。

hpRNA载体设计过程中，靶基因反向重复片段的长度和位置将影响基因沉默的效率。植物中一般采用几百bp的靶基因片段构建载体，Matzke等采用大约300bp的Nos启动子序列反向重复形成的dsRNA与273bp的环就足以诱导产生有效的RNA沉默。Chuang等采用288~409bp的序列片段，也获得良好的抑制基因表达效果。一般认为靶基因序列应选择基因编码区片段，但Stoutjesdijk等采用FAD2基因的5′UTR片段也有效地沉默了该基因。Brummell等将农杆菌的3'UTR序列的反向重复片段连接于多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因片段用于番茄转化，91%的植株表现出PG基因抑制现象，成熟果实中PG的mRNA含量降低98%以上。

早先设计的RNA沉默载体一般选用强的组成型启动子如35SCaMV启动子(对于双子叶植物)或玉米ubiquitin1启动子(对于单子叶植物)启动dsRNA或ihpRNA的表达。当对目的基因的沉默表现出致死性状时，则需要构建诱导型的基因沉默载体。在植物诱导型表达系统中，几个由化学物质(四环素、铜、乙醇和类固醇等)响应的载体已被报道，其中一个比较有效的启动子系统是基于菌类Aspergillusnidulans的alc基因开关。它是由乙醇诱导的，当存在乙醇时AlcR结合到修饰的alcA启动子区域并使沉默区段得到表达，除去乙醇则表达被终止。研究证明alc沉默系统在拟南芥、烟草、马铃薯块茎中均有较高的效率。然而应用化学物质作为诱导剂可能产生生长扰乱，例如糖皮质激素诱导系统就可能扰乱植物的正常生理活动。对拟南芥HSP18基因的研究发现在植物中它可以作为一个有效的热激诱导系统，Masclaux等应用来自拟南芥的HSP18启动子构建了几个热激诱导的基因沉默系统。与组成型CaMV35S启动子构建的基因沉默系统相比，该系统成功的沉默了内源PDS基因并表现出热诱导的特性，为其应用打下了基础。

3RNA沉默在植物中的应用领域

3.1RNA沉默在植物功能基因组研究中的应用

后基因组时代的重要挑战是揭示基因组中所有基因的功能。分子生物学研究中经常采用减少或失活基因表达，通过对表型的观察来确定基因的功能。插入突变在这种研究中是一个非常有用的工具。两种插入突变的策略，T-DNA和转座子标签，已经在拟南芥中取得大规模应用并以此产生了几个大的公共拟南芥插入突变体库。尽管这些突变体库提供了非常好的研究材料，但通过这些方法得到的插入突变有几个缺点，如不能应用于多拷贝基因的研究、对基础调控基因的插入可能产生致死型突变、插入位点随机因此不能针对某一特定基因进行突变。RNA沉默技术则在很大程度上克服了这些缺点。由于RNA沉默是一个同源序列依赖性的过程，对于目标序列的细心筛选能保证基因家族的个别基因被沉默，或者通过设计高度保守序列部分使基因家族的多个成员被沉默。RNA沉默还可以被用来对管家基因进行研究，利用诱导型启动子构建的RNA沉默系统或者对植物进行瞬时RNA沉默可以使管家基因的沉默发生在特定生长阶段或组织器官内。

RNA沉默在线虫中已经有了非常有效地针对功能基因组的应用，植物RNA沉默技术的发展为高通量植物基因功能的揭示提供了条件。Chuang等在花发育研究中采用RNA沉默技术验证了AG、CLV3、APl、PAN等已知功能基因,并开创了RNA沉默技术在植物功能基因组学中的应用。Lu等也在烟草由Pto引起的抗性研究中，利用RNA沉默随机从5000个烟草cDNA中分析其功能。Byzova等利用hpRNA介导的基因沉默技术抑制拟南芥和甘蓝型油菜的花发育相关基因的表达，获得花冠发育为萼片的拟南芥和萼片状花冠的油菜，并且这些性状能够稳定遗传。最近,Miki等利用水稻OsRac基因家族保守性序列设计RNA沉默载体，成功的对OsRac基因家族进行了沉默，发现该突变株系生长状况和植株高度均比正常的要差，揭示该基因家族在生长发育过程中有重要的作用。

为适应高通量基因功能研究的需要,高效沉默载体的构建是研究的热点。其中pHELLSGATE高通量基因沉默载体和一个烟草的高通量VIGS载体都利用了Gateway重组技术来取代传统的耗时、繁琐、低效的以限制性内切酶为基础的克隆步骤。Gateway系统的被应用在由拟南芥基因组RNAi敲除系列株分析协会来构建一个以pHELLSGATE为基础的载体pAGRIKOLA以产生所有拟南芥基因的ihpRNA结构，并构建RNA沉默的拟南芥植株通过表型来确定基因功能。对于管家基因和表达调控因子的基因他们还计划利用诱导型启动子来构建RNA沉默植株，这些材料无疑将给拟南芥功能基因组研究带来不可取代的资源。

3.2RNA沉默在作物品质改良中的应用

尽管产量问题在传统育种和植物遗传工程研究中是最重要的目标,改善植物营养价值方面也越来越受到重视。常规育种方法在改善食物营养方面取得了卓有成效的成功，然而操作耗时，并且对于作物性状的改良只限于已经得到的突变体材料。而利用RNA沉默技术，其优越性不仅表现在可操作基因的范围和突变的种类扩大了，而且对目的基因的表达有了可控性。

利用RNA沉默技术已经成功的进行了多种作物不同方面的品质改良。应用RNA沉默技术进行22kDa玉米贮存蛋白(一个赖氨酸含量低的蛋白)的敲除得到了一个显性的高赖氨酸含量突变株。传统育种也曾得到一个隐性高赖氨酸含量的突变株，该突变株所突变的O2基因是一个玉米亮氨酸拉链调控因子，控制包括22kDa蛋白的一系列贮存蛋白的表达。尽管该突变株是富含赖氨酸的，但因为种子质量和产量的下降使该突变株在农业中应用价值并不大。相反，对于玉米低赖氨酸的22kDa贮存蛋白进行RNA沉默并没有改变O2的功能，但产生了高质量的富含赖氨酸的种子。Liu等利用RNA沉默技术进行了棉籽油成份的改良研究,通过抑制2个脂肪酸去饱和酶关键基因Δ92去饱和酶编码基因ghFAD21和ω62去饱和酶编码基因ghFAD221的表达，分别将硬脂酸含量从非转基因的2%~3%提高到40%，油酸含量从15%提高到77%，并表明通过上述后代的杂交可获得同时提高硬脂酸和油酸的植株，而且基因沉默程度没有降低。进一步显示出RNA沉默在农作物改良方面应用的优越性。李加瑞等利用RNA沉默技术进行小麦淀粉品质改良的研究，将颗粒结合型淀粉合成酶(Granule-boundstarchsynthaseI，WAXY)基因沉默，得到了直链淀粉含量明显下降的植株。供试小麦品种扬麦10号广泛应用于生产实践，使得沉默植株有潜在的应用价值。Ogita等利用RNA沉默技术抑制咖啡植物中编码可可碱合成酶(CaMXMT1)基因的表达,转基因植物中可可碱含量下降了30%~80%，咖啡因含量下降50%~70%，这将使咖啡因对敏感人群的刺激降低，使引发心悸、高血压、失眠等症状减少。可以预见，RNA沉默在植物品质改良上将会有更广泛的应用。

3.3利用RNA沉默产生抗病毒植物

将病毒的某一序列设计成双链结构导入植物体使之表达,可诱发RNA沉默强化植物体内天然的RNA沉默抗病毒能力，这使得高抗病毒性的转基因植物的获得成为可能。Waterhouse等利用马铃薯Y病毒(PVY)蛋白酶基因片段构建IRS载体进行烟草转化，获得抗性植株。Wang等利用含有大麦黄矮病毒(Barleyyellowdwarfvirus，BYDV)PAV株系的复制酶基因片断构建成可产生发夹式RNA结构的载体，并将该载体导入大麦得到强抗性植株并得到稳定遗传。Kalantids等在转黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)cDNA反向重复序列的再生烟草植株中检测到一个完全抗性的株系，并且证实烟草病毒抗性直接与siRNA的产生相关。同时接种病毒的转化植物体表现出敏感型、恢复型(表现症状但新长出的叶片无症状)、完全抗性3种表型。其中的敏感型尽管对病毒敏感，但症状要比对照轻得多。这三种表型除了说明RNA沉默信号在植物体内可以扩散产生系统性沉默外，还说明利用RNA沉默手段获得的抗性植株的抗性强度大小并不完全一致。

在RNA沉默抗病毒的方法研究上，Tenllado等观察了以直接注射和农杆菌介导转化两种方式将病毒dsRNA导入植物叶片细胞后的结果发现，两种方式都成功阻止了烟草蚀刻病毒(Tobaccoetchvirus，TEV)、辣椒轻斑驳病毒(Peppermildmottlevirus，PMMoV)和苜蓿花叶病毒(Alfalfamosaicvirus,AMV)的侵染过程。同时他们还将用于直接注射的dsRNA进行稀释处理发现dsRNA诱导的植物病毒抗性是dsRNA剂量依赖的，这与在动物上得出的结论一致。而Pandolfini等的实验结果表明,即使导入烟草的李痘病毒(Plumpoxvirus，PPV)基因组片断含有可剪切的内含子序列,在转化体中也可以检测到转化片断siRNA的存在，并表现出对PPV侵染的系统抗性。在dsRNA双螺旋区域的长短设计方面，针对糖原合成酶激酶(Glycogensynthasekinase，GSK)基因进行的RNA沉默结果表明，在19nt的基础上再增加siRNA配对区域的长度不能增强RNA沉默表现出来的干扰作用。因此,载体可以只表达21nt(19nt的双链区和3'突出的两个碱基)的siRNA来达到RNA沉默的目的。然而同一基因不同区域的siRNA产生的沉默效应可能不同，所以在实验时应该比较多个不同序列的siRNA，然后确定干扰效果最好的siRNA序列。另外,通过在siRNA的正义链3'端增加1至4个不配对的核酸，强化siRNA的双螺旋结构，可能也是提高培养细胞中RNAi活性的一种手段。

3.4RNA沉默在其他方面的应用

RNA沉默在其他方面也慢慢显示出它已经成为基因操作一个强大的技术工具。在生态学研究方面，oxylinpin信号途径被认为在植物防御体系中发挥直接或间接的作用，Kessler等沉默了烟草中3个在oxylinpin信号途径中起作用的酶，结果发现该烟草更易被草食动物吃掉，并且它还吸引了其他种类草食动物的进食。Steppuhn等利用hpRNA载体沉默了两个pmt(genesputrescineN-methyltransferase)基因，抑制了烟碱的合成。结果发现RNA沉默植株比自然植株更易成为草食动物进食的对象，比自然植株减少3倍的叶子数量，这一研究阐明了烟碱在植物防御机制中起着重要的作用。这些研究使遗传沉默植物在自然界中生物之间的互作研究中得到应用。另外,随着相关研究的进行，利用RNA沉默进行花卉新品种的开发、对作物中过敏源的去除等方面的研究也将会带来更多实际的应用。

4 前景展望

目前根据拟南芥和水稻的测序结果已得到了大量的基因序列，并利用比较基因组学的方法对其中许多基因的功能作了预测，利用RNA沉默技术对这些基因进行大规模的分析鉴定，将有可能分离出大量发育调控、逆境抗性及品质形成等方面的基因，这对于植物科学的理论研究和作物遗传改良的实践都有重要意义。另外，利用模式植物中已知功能基因的保守序列，,通过PCR扩增的方法在近缘生物中得到了的大量候选基因，RNA沉默技术也为这些候选基因的鉴定提供了一条新的途径。因此有理由相信，RNA沉默技术在植物基因功能研究、生长发育和性状改良等各个领域将发挥越来越重要的作用。