推荐：RNAi—双链RNA引起的基因敲除

CMBI 评论员 李黔

　　1995年，康奈尔大学的Su Guo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义和正义RNA都阻断了基因的表达，他们对这个结果百思不得其解。直到1998年， Andrew Fire的研究证明，在正义RNA也阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA[1]。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的。这种双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干预（RNA interference,RNAi）。随后的研究中发现，RNAi现象广泛存在于线虫，果蝇，斑马鱼，真菌以及植物等 生物 体内，这些 生物 体利用RNAi来抵御病毒的感染，阻断转座子的作用。RNAi能高效特异的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果。在小鼠和人的体外培养细胞中利用RNAi技术也成功阻断了基因的表达，实现了细胞水平的基因敲除。近几年来RNAi的研究取得了很大进展，它被《Science》杂志评为2001年的十大科学成就之一。2002年RNAi的研究又有了新的突破，发现它在基因表达调控中发挥重要作用，它也名列2002年《Science》杂志评的十大科学成就之首。

一. RNAi的机理

目前RNAi的作用机理主要是在线虫，果蝇，斑马鱼等生物体内阐明的。生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染，转座子的转录产物，外源导入的基因。这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制，结果是病毒被清除，转座子的表达被阻断，外源导入基因表达被阻断同时，与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。

㈠ 参与RNAi反应的酶

RNA酶Ⅲ是一种能切割双链RNA的酶，参与RNAi反应的Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的一个成员。Dicer酶广泛存在于蠕虫，果蝇，真菌，植物及哺乳动物体内。它的结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点。在Dicer酶的作用下，双链RNA被裂解成21到23个核苷酸的片断，称为siRNA（short interference RNA）[2]，它启动了细胞内的RNAi反应。

由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中，研究者们推测细胞内存在RNAi效应的扩增系统。研究者们发现，在真核细胞中也存在能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶（RNA-directed RNA polymerase，RdRP）。在RdRP的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增。

㈡ RNAi的反应过程

双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，Argonaute2是目前唯一已知的参与复合物形成的蛋白[3]。此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链[4，5]。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。