腺病毒引起的眼部感染

人腺病毒（adenovirus，ADV）最初是从人的腺体中分离得到，故称为腺病毒。人腺病毒有 68 个血清型，可感染上皮细胞引起上呼吸道感染。腺病毒在世界各地引起感染，各个年龄组人群均可感染，但儿童多见，与其他呼吸道病毒相比季节性不明显。腺病毒还可引起眼部感染，其复杂的眼部症状是由年龄、宿主免疫状态以及病原体独特的组织嗜性引起不同感染位点而形成的。

器材：

① 一次性无菌手套

② 采集管

③ 电子显微镜

④ PCR 仪

⑤ 培养箱

试剂：

① 材料：采集标本

② 标本缓冲液

眼部腺病毒感染标本采集与处理、分离培养及检测、预防及治疗基本过程如下：

一、标本采集

（1）眼睑标本采集：不需局部麻醉。可以用蘸有无菌磷酸盐缓冲液的棉签擦拭眼睑边缘。

（2）眼结膜标本采集：准备好无菌、湿棉签，让患者的眼睛朝上看，拇指将下眼睑往下拉，用湿的无菌棉签由内侧往外侧来回擦拭结膜囊一次，避免只收集眼泪。

（3）角膜标本采集：局部麻醉后 3~5 分钟，用无菌棉签刮去眼睛脓液并弃之，采样助手将上、下眼睑分开，借助裂隙灯，用抹刀或无菌一次性刀片取角膜材料。

将上述采集到的标本立即投入无菌生理盐水或 Eagle 液或 0.5％水解乳蛋白 Hanks 的小管中，贴上标签，置冰壶内携至实验室，-70 ℃冰箱保存。

（4）血清标本采集：采集静脉血 2 ml。血清学方法证实或诊断需要配对的血样，第一份样品在症状出现后应尽快采集，第二份应在 2～4 周后采集，待血液凝固后，在无菌的条件下分离血清，于 -20 ℃保存。

二、标本的处理

腺病毒标本加抗生素处理过夜，离心取上清液。

三、分离培养

（1）常规分离培养：① 接种：接种处理过的上清液到单层细胞。分离培养液牛血清含量改为 1％，其余不变。② 观察：37 ℃孵育，可观察到典型的细胞病变为细胞变圆、肿胀、聚集呈葡萄状。③ 盲传：培养 7~10 天后仍无细胞病变时，或者其他技术也未显示培养物中有相应病毒的存在，可将培养细胞收获，再接种细胞，盲传 3 代后，仍无细胞病变或者其他检测均阴性时，可认为病毒分离阴性。④ 收获：当 76％~100％细胞出现病变时进行收获，收获之前可以将细胞放于 -70 ℃冰箱，冻融 1~2 次，以提高收获物的病毒滴度。先温和摇动细胞瓶数次，然后用 10 ml 的无菌移液管吸取病毒液置于 15 ml 的无菌离心管中，混匀病毒。收获的病毒液可以立进行后续试验，或分装至冻存管中保存在 -70 ℃冰箱待用。

（2）Shell vial 分离培养：Shell vial 是一种特制的细胞培养管，底部平，管内有一圆形玻片，管口塞子是用可通过显微镜光源的特殊材料制成。细胞可在玻片上生长，标本接种到长有细胞的 Shell vial 培养管后，可通过离心方法，增加病毒对细胞的吸附，提高感染率。孵育 1~2 天，取出玻片进行快速检测。

四、检测

（1）病毒抗原检测：分离培养的细胞可用荧光标记的抗六邻体抗体与之作用进行快速检测，鉴定是否存在腺病毒。也可用血凝抑制（hemagglutination inhibition，HI）试验或中和试验（neutralization test，NT）检测腺病毒的属和组特异性抗原并鉴定病毒的血清型。

（2）聚合酶链反应 是最敏感、快速检测腺病毒 DNA 的方法。用常规方法提取标本中 DNA 模板，对临床标本中的腺病毒进行直接检测时，两步的套式 PCR 可以提高阳性率。可用来自六邻体基因高度保守区互补引物扩增 B、C、D、E、F 亚属腺病毒 DNA。外引物 hex1885deg 的序列为：5＇-GCC（C/G）CA（G/A）TG G（G/T）C-3＇；外引物 hex1913deg 的序列为：5＇-CAG CAC（G/C）CC ICG（A/G）AT GTC AAA-3＇；扩增 DNA 片段长度为 301bp。内引物 nehex1893 的列为：5＇-GCC CG（C/T）GC（A/C）ACI GAI AC（G/C）TAC TTC-3＇；内引物 nehex1905deg 的序列为：5＇-CC（C/T）AC（A/G）GCC AGI GT（A/G）（A/T）AI CG（A/C）（A/G）C（C/T）TTG TA-3＇，扩增 DNA 片段长度为 171 bp。

（3）免疫荧光试验 检测腺病毒抗原。是将未冷冻的细胞标本洗涤后，重悬于磷酸盐缓冲液，用丙酮固定于载玻片上，与抗六邻体（或抗毒粒）血清及抗免疫球蛋白偶联物反应。致密的细胞核和细胞质的点状染色属于腺病毒的阳性反应。

（4）酶联免疫试验 检测腺病毒抗原。是将多克隆捕捉抗体吸附到板子上，然后依次加入抗原样本或样品、来自不同种动物的第二多克隆抗体（检测抗体）、酶偶联的抗种抗体以及底物、显色系统。检测抗体使用单克隆抗体，可提高灵敏度，如果捕捉抗体和检测抗体都是单克隆抗体，则灵敏度可进一步提高。

（5）抗体检测 可以用免疫荧光试验、酶联免疫试验检测患者腺病毒抗体。但由于腺病毒抗体检测需要双份血清抗体有 4 倍以上升高，所以用于临床诊断是非常滞后的。

五、预防及治疗

腺病毒具有很强的传染性。很多 EKC 患者的手携带腺病毒，洗手并不能有效地去除手指上污染的腺病毒，因此对 EKC 患者进行检查时应戴手套。腺病毒在水槽中可以存活数周，擦手纸也可以作为传染源。可将患者和家庭成员强制性隔离。眼科医生办公室常常也是传播来源，因此对患者进行眼科检查时应按标准程序操作。酒精、去污剂、氯己定不能对眼科器具进行很好的消毒，1％次氯酸钠浸泡 10 分钟或高压蒸汽消毒眼科器具是最有效的方法。游泳池氯化消毒不足时也可以导致腺病毒感染暴发。腺病毒可诱导有效、持久的免疫力。目前尚无有效疫苗和特别的抗病毒治疗方法，主要采取对症治疗。