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几种果实总RNA提取方法的评价

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广东农业科学 陈弟 多种RNA 提取方法的原理
Trizol法即异硫氰酸胍—苯酚法,异硫氰酸胍可以抑制RNA酶、防止RNA的降解,而酚的作用是使蛋白变性。其原理是内含异硫氰酸胍能迅速破碎细胞,同时使核蛋白复合体中的蛋白变性并释放出核酸;由于释放出的DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同,且分别位于中间相和水相,从而使DNA和RNA得到分离;取出水相后,通过有机溶剂(氯仿)抽提及异丙醇沉淀,可得到纯净RNA。
热硼酸法 (Hot-borate,简称HB法)的原理是将硼酸缓冲体系、蛋白酶K消化蛋白和LiC1选择性沉淀RNA等步骤偶联在一起。硼酸可与酚类化合物依靠氢键形成复合物, 二硫苏糖 醇(DTT) 作为还原剂, NP-40 可阻止酚类物质氧化,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可与多酚化合物形成复合体,这些物质都可以抑制植物组织中酚类物质的氧化及其与RNA的结合,通过LiC1沉淀剩余的酚类物质,从而与RNA分开。
异硫氰酸胍法(Guanidine Thiocyanate,简称GT法)的提取液包括4 mol/L异硫氰酸胍、25 mmol/L柠檬酸钠( p H 7.0 )、0.5%十二烷基肌酸钠、0.1 mol/Lβ-巯基乙醇。其中,异硫氰酸胍作为强变性剂使核酸一蛋白结构发生变化,并有效解离核蛋白与核酸的复合体, 与β-巯基乙醇共同对RNase产生强烈的抑制作用,这样能破裂细胞并迅速释放核酸,然后通过CsCl梯度密度离心去除DNA,有效地得到总RNA。
十二烷基硫磺酸钠法(Sodium Dodecyl Sulfate,简称SDS法) 的提取液有 0.1 mol/L Tris-HCl (pH8.0)、0.05 mol/L EDTA (pH8.0)、0.5 mol/L NaC1、1.5%SDS、0.01%β-巯基乙醇。 SDS 是一种离子去污剂,能从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖;EDTA以螯合二价金属离子,抑制RNA酶的活性,防止RNA降解;Tris-HCl不仅起缓冲作用,还可防止RNA降解;NaC1溶液可提供缓冲反应环境。在缓冲液中加入抗氧化剂或强还原剂(如β-巯基乙醇),可以降低酶类(尤其是氧化酶类)的活性。通过苯酚和氯仿等有机溶剂的抽提去除蛋白质、多糖和酚类等杂质后,加入无水乙醇进行沉淀,即可使RNA分离出来。
十六烷基三甲基溴化铵法(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide. 简称CTAB法)的抽提缓冲液包括2% CTAB、100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、1.4 mol/L NaC1、20 mmol/L EDTA (pH 8.0)。其中,CTAB作为离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使RNA得以游离出来;EDTA以螯合二价金属离子抑制RNA酶的活性,防止RNA降解;Tris-HCl不仅起缓冲作用,还可防止RNA降解;NaC1溶液提供缓冲反应环境。在缓冲液中加入抗氧化剂或强还原剂(如β-巯基乙醇) ,以降低酶类(尤其是氧化酶类) 的活性。而添加的苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性并使抽提液分相,由于RNA溶于水相,因此经离心后即可从抽提液中去除细胞碎片和大部分蛋白质;上清液中加入的无水乙醇可使 RNA沉淀,将沉淀出的RNA溶于TE溶液中即得RNA溶液;添加的还原剂(如β-巯基乙醇)和鳌合剂(如PVP) 可防止多酚氧化;低浓度乙醇或醋酸钾可去除多糖,从而达到高度纯化RN A的目的。
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