多重PCR同时检测口蹄疫病毒、猪水疱病病毒和水疱性口炎病毒

钟金栋 ¹ ,花群义 ^undefined ,肖荣海 ² ,夏雪山 ¹ ,杨云庆 ² ,周晓黎 ² ,董 俊 ² ,邓祖洪 ³

（1.昆明理工大学生化学院,云南昆明 650224;2.云南出入境检验检疫局技术中心，云南昆明 650228; 3.西双版纳兽医站,云南景洪 666100）

 

摘 要：根据基因库中的口蹄疫病毒（FMDV），猪水疱病病毒（SVDV）和水疱性口炎病毒（VSV）各基因序列，设计了与FMDV，SVDV和VSV互补的3对特异性引物，对样品中的cDNA模板进行了多重PCR扩增及反应条件的优化，结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带，分别为189 bp，125 bp和300 bp。用这3对引物对病毒样品cDNA模板进行多次扩增，均能稳定得到与设计相符合的3条特异性条带。本试验能特异、敏感、快速地鉴定FMDV，SVDV和VSV。

关键词：口蹄疫病毒；猪水疱病病毒；水疱性口炎病毒；多重PCR；检测

口蹄疫（Foot and mouth disease,FMD）、猪水疱病(Swine vesicular disease,SVD)和水疱性口炎(Vesicular stomatitis,VS)都是猪的重要病毒性传染病，以口和蹄部产生水疱性损伤为特征，其临床症状极为相似，引起严重的公共卫生问题，均被世界动物卫生组织（OIE）列为A类传染病。3种水疱性疾病在临床症状上无法区别，必须通过鉴别诊断。目前对3种疫病的诊断多采用病原分离及常规的血清学方法，所需时间较长，也有使用PCR技术进行检测的，但还没有建立稳定的操作性强的能同时鉴别3种病毒的方法。为此，有必要建立能同时进行3种疫病快速检测方法，以便尽快采取有效的针对性防控措施。多重PCR技术是在同一PCR体系中，加入多对引物，对多种目的基因同时扩增的分子生物学检测方法，它具有快速、灵敏、特异等优点 ^[1] 。因此，建立对FMDV，SVDV和VSV的多重PCR鉴检测方法是十分必要的。本研究利用计算机软件对已知3种病毒基因进行分析，确定出扩增病毒基因的靶序列，设计筛选出适合于多重PCR的FMDV，SVDV和VSV特异性扩增的3对引物，并通过对扩增体系和扩增条件的优化，建立了特异、敏感、快速的能同时检测FMDV，SVDV和VSV的多重RT-PCR方法。

1 材料与方法

1.1 病毒株

猪水疱病病毒RNA、标淮阳性血清、标淮阴性血清和参考样品由英国动物卫生研究所Pirbright实验室惠赠;VSV-NJ病毒株和VSV-IND病毒株从美国国家兽医服务实验室（NVSL）引进，由本实验室保存；FMDV O疫苗株从云南保山疫苗厂引进，由本实验室保存。

1.2 试剂

Total RNA提取试剂盒Trizol Rwgent购于美国Invitrogen公司；三氯甲烷，异丙醇， Taq 酶，dNTP Mixture，AMV逆转录酶，RNase Inhibitor，及DNA标准DL 2 000购自宝生物（大连）有限公司。

1.3 引物设计及合成

根据基因库提供的FMDV，SVDV和VSV各基因序列，通过Blast分析软件分别对基因的序列进行分析，选择了高度保守即特异性强的区段，应用计算机Primer软件设计了3对特异性引物，引物由宝生物（大连）工程有限公司合成，其序列及扩增基因产物的长度见表1。

 

表1 多重RT-PCR引物设计结果

Table 1 Result of primer design for multiplex RT-PCR

 

 

1.4 病毒RNA的提取和反转录

取1 mL～1.5 mL组织样品研磨上清液或液体样品置1.5 mL eppendorf 管中，于4 ℃以10 000 r/min离心5 min，弃上清液；加入1 mL TrizoL，充分振荡混匀，置室温5 min，彻底裂解；加入200 μL三氯甲烷，小心盖上帽盖，用力快速振荡15 s，置室温放置3 min；于4 ℃以10 000 r/min离心15 min；小心吸取上层水相，转移至新的1.5 mL eppendorf管中，加入500 μL异丙醇，混匀室温放置10 min；于4 ℃以10 000 r/min离心10 min，弃上清液；加1 000 μL 750 mL/L乙醇，充分振荡混匀，于4 ℃以10 000 r/min离心5 min，小心弃上清液，管底部可见有乳白色RNA沉淀；小心打开管盖，室温自然干燥沉底的RNA；用DEPC水溶解RNA，用核酸蛋白分析仪检测RNA的纯度和浓度，然后可直接用于反转录或-70 ℃保存备用。

1.5 cDNA的反转录

取1支200 μL PCR反应管，反应总体积为20 μL，RT 5×buffer 4 μL，RNA（5 U/μL）酶抑制剂0.5 μL，10 mmol/L dNTPs 6 μL，下游引物1 μL，AMV（5 U/μL）逆转录酶0.5 μL，灭菌双蒸水补足至20 μL。置室温10 min，42 ℃水浴60 min，最后94 ℃ 5 min灭活AMV逆转录酶，然后置于冰盒，则反转录为cDNA。

1.6 常规PCR及扩增条件优化

PCR反应在带热盖的Gene Amp PCR System 9 700型中进行。分别将上述FMDV，SVDV和VSV的cDNA产物作为模板，在管内分别加入相对的3对引物进行PCR扩增。反应条件以5 μL为模板，稀释好的引物PF和PR各1 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10×buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl ₂ 5 μL，5 U/μL Taq 酶1 μL，加水补足50 μL。PCR反应循环参数为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃复性40 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR产物在20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 多重PCR扩增

分别将上述1.5合成的FMDV，SVDV和VSV cDNA产物作为模板，在同一管内同时加入3对引物进行PCR扩增。反应条件及PCR反应参数如上1.6。PCR扩增结束后取10 μL扩增产物于20 g/L的琼脂糖凝胶（含0.5 μg/ mL溴化乙锭）中电泳检测。