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感受态大肠杆菌制备方法

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试剂 配制:
A 液:1M,MnCl2;mol/L
B 液:1M,HEPES,pH=6.2-6.8,用无菌水配,配后不需灭菌;
C 液: 称取CaCl2 0.10g,KCl 1.18g,全部转入细口 试剂 瓶,然后加入46ml 三蒸水(一级水),轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎,然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。
TB 缓冲液:
方法步骤:
1、溶液配制取1 管B 液(0.6ml),全部加入C 液(46ml)中,混匀后,再用1ml 移液器加入3.3ml A 液,混匀冰浴即可使用。
2、划线得到单菌落37℃培养箱培养过夜(约17h), 挑取2-4 个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡(300 rpms)培养3-4 小时, 将培养温度调至18℃剧烈振荡(328 rpms)培养,
3、其余与普通感受态差不多,每管加入4ml TB 缓冲液,轻轻振荡,使菌体重新悬浮,
4、加入280ml DMSO(可用国产分析纯),混匀后分装入1.5ml EP 管,冰上静置15 分钟。
5、用纱布将所有装有感受态的EP 管包好,用棉线系好后放入液氮中速冻,在液氮中静置12小时以上
6、取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。
效率非常高,一般可到10×8,好时可到10×9,特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。
洁净是最重要的。无菌都无所谓,在操作台上可正常操作。离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。涂板要注意,不要觉得不匀而多次反复,轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可,特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2 小时以上的板。涂完后建议空气晾干(20-30 分钟)这样会减少卫星菌落出现。
预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要,只要注意就行了,我在去残液时经常在室温倒置1min,对感受态效率提高有帮助,第一次多加一点缓冲液,我经常加至20ml,效果不错。
关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多,最复杂的莫过于电转化,而最简单的则是将LB 平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP 管冰箱即开始转化。对于做克隆工作的人而言,高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。
现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化,可达到1010,但是操作起来比较麻烦。要想又简单,又能有较高的转化效率,最好的莫过于1990 年《gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。
根据实验室的实际情况,我们将其稍作修改,做成了GLP 文件,但其中仍有许多可改进或需要注意的地方,其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助。
1、所用器具的洁净程度。这一点非常重要,是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的,毋庸置疑。
2、培养基的装量:培养基的装量是很重要的,这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题,是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值为:培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml,50ml/250ml。
3、培养基的pH 值。这是讲的pH 值并非单指配置或灭菌后的pH 值,而且还包括整个摇瓶结束后的pH 值。一般来说,接种前的pH 值在6.8-7.2,等菌摇好后,可以测一下pH 值,不要低于6.0,最好在6.5 以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢,生长状态良好,按要求做,肯定效率不低。
4、培养后的OD 值。其实这并一个非常重要的参数,只是当OD 值大到一定的程度后,菌体要保持对数生长已经不太可能,因此很多指导方法上强调OD 不得大于0.6,0.8 等等。同时,OD值大时菌体总量大,因而感受态绝对数量要大一点,因而需要在OD 值的两方面影响中找一个平衡点。
5、培养基中的各种离子。经验证明,当培养基中存在一定量的Mg2+离子时,该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时,使用20mM MgCl2 做为培养基的添加物,在感受态收获之前20-30 分钟加入,会收到很好的效果。
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