大肠杆菌感受态制备

[ 实验目的 ]

通过本实验掌握大肠杆菌感受态细胞的制备。

[ 实验原理 ]

细菌处于易于吸收外源 DNA 的状态叫感受态。细菌处于 0 ℃ 的 CaCl 2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经 42 ℃ 段时间短时间热激处理，促进细胞吸收 DNA 复合物。

[ 仪器、材料与试剂 ]

1. 超净工作台

2. 低温离心机

3. 恒温摇床

4. 高压灭菌锅

5. 恒温水浴锅

6 ．培养皿

（二）材料与试剂

1 ． 细菌： DH5

2 ． 100 mmol/L CaCl 2 （灭菌）

3 ． LB 培养基：配制每升培养基，应在 950 ml 去离子水中加入

胰蛋白胨 10 g

酵母提取物 5 g

NaCl 10 g

摇动容器直至溶解，用 5mol/L NaOH ( 约 0. 2ml ) 调节 pH 值至 7. 0 ，加入去离子水至总体积为 1L ，高压灭菌 20min 。

4 ． LB 琼脂培养基：先按上述配方配制液体培养基，高压灭菌前加入琼脂 16 ～ 18 g 。

[ 实验步骤 ]

1. 挑取大肠杆菌单菌落接种于 20mL LB 培养基中， 37℃ 振荡培养过夜。

2. 按 1% 接种量接种 20mL LB 培养基中， 37℃ 230 转 /min 振荡培养 3 h 。

3. 取 1ml 培养物，冰浴 30 min ， 4℃ 4,000 r/min 离心 3 min ，去上清。

4. 加 500ul 体积的冰冷的 0. 1 mol/L CaCl 2 溶液，重新悬浮细菌沉淀， 4℃ 4,000 r/min 离心 3 min ，去上清。

5. 加 100ul 体积的冰冷的 0. 1 mol/L CaCl 2 溶液，重新悬浮细菌沉淀， 4℃ 4,000 r/min 离心 3 min ，去上清。

6. 50ul 体积的冰冷的 0. 1 mol/L CaCl 2 溶液，重新悬浮细菌沉淀，冰浴 3 h-24 h ，即为大肠杆菌感受态细胞。