用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌实验
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原理
可以用于批量制备感受态细胞，其转化效率可达到 5X106~2X107 个转化克隆/μg 超螺旋质粒 DNA。这个转化效率对于方便地进行质粒中克隆已经足够高了。用此方法制备的感受态细胞可以在 -70℃ 冻存。但随着冻存期的延长，转化效率会有所降低。
材料与仪器
质粒 DNA
标准的转化缓冲液 CaCl2·2H2O MgCl2-CaCl2 溶液 LB 或 SOB 培养液 SOB 琼脂板 SOC 培养液
Sorvall GSA 转头或与之相当的转头 聚丙烯管 水浴装置
标准的转化缓冲液 CaCl2·2H2O MgCl2-CaCl2 溶液 LB 或 SOB 培养液 SOB 琼脂板 SOC 培养液
Sorvall GSA 转头或与之相当的转头 聚丙烯管 水浴装置
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
(1) CaCl2·2H2O ( 1 mol/L)
制备感受态细胞时，取出 10 ml 贮存液加 90 ml 纯水稀释至 100 ml，用预先处理的 Nalgene 滤膜（0.45 μm 孔径）过滤除菌，放置冰上。
或
标准的转化缓冲液（TFB )
对许多大肠杆菌的菌株，用标准 TFB 代替 CaCl2 可获得一致或更好的结果
(2) MgCl2-CaCl2 溶液，冰上预冷。
2. 培养基
(1) LB 或 SOB 培养液（培养最初的细菌生长物）
(2) SOB 琼脂板，含 20 mmol/L MgSO4 和适当的抗生素。
标准的 SOB 琼脂板含 10 mmol/L MgSO4。
(3) SOC 培养液
每个转化反应约需 1 ml。
3. 核酸和寡核苷酸
质粒 DNA ( 重组质粒）
4. 离心机和转头
Sorvall GSA 转头或与之相当的转头
5. 专用设备
(1) 聚丙烯管（50 mm)，冰上领冷
(2) 聚丙烯管（17X100 mm；Falcon 2059)，冰上预冷
(3) 可调至 42℃ 的水浴装置。
二、方法
1. 制备感受态细胞
(1) 从 37℃ 培养 16~20 h 的平板中挑取一个单菌落（直径 2~3 mm)，转到一个含有 100 ml LB 或 SOB 培养基的 1 L 烧瓶中。于 37℃ 剧烈振摇培养 3 h。一般经验，1OD600 约含有大肠杆菌 DH1 109 个/ml。
为达到高效转化，活细胞数务必少于 108 个细胞/ml，对于大多数大肠杆菌来说，这相当于 OD600 值为 0.4 左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔 15~20 min 测定 OD600 值来监测，用监测的时间及 OD600 值列一个图表，以便预测培养物的 OD600 值达到 0.4 的时间，当 OD600 值达到 0.35 时，收获细菌培养物。
在菌株与菌株之间，OD600 值与每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定肠杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的 OD600 值，并将各稀释浓度的培养物铺于无抗生素的 LB 琼脂板以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度计读数得到标准化。
(2) 将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的 50 ml 聚丙烯管中，在冰上放上 10 min，使培养物冷却至 0℃。
(3) 于 4℃ 用 Sorvall GS3 转头（或与之相当的转头）以 4100 r/min 离心 10 min，以回收细胞。
(4) 倒出培养液，将管倒置 1 min 以使最后的痕量培养液流尽。
(5) 每 50 ml 初始培养液用 30 ml 预冷的 0.1 mol/L CaCl2-MgCl2 溶液（80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2 ) 重悬每份细胞沉淀。
(6) 于 4℃ 用 Sorvall GS3 转头（或与之相当的转头）以 4100 r/min 离心 10 min，以回收细胞。
(7) 倒出培养液，将管倒置 1 min 以使最后的痕量培养液流尽。
(8) 每 50 ml 初始培养物用 2 ml 用冰预冷的 0.1 mol/L CaCl2（或 TFB）重悬每份细胞沉淀。
(9) 此时，可以按步骤 10~16 用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于 -70℃。（见 “制备和转化感受态大肠杆菌的 Hanahan 方法 ( 高效的转化策略 )”）。
对大多数大肠杆菌（MC106 除外)，在这一步采用 TFB 代替 CaCl2 可得到相同或更好的结果。
Dagert 和 Ehrlich 的实验（1979 ) 曾表明，细胞可以于 4℃ 在 CaCl2 溶液中保存 24~48 h，在贮存的最初 12~24 h 内，转化率增加 4~6 倍，然后降低到初始水平。
2. 转化
包括阳性和阴性对照。
(10) 用冷却的无菌吸头从每份用 CaCl2 溶液制备的感受态细胞悬液中吸取 200 μl 转移到无菌离心管（17X100 mm）中，每管加入 DNA（用不超过 10 μl 的体积，其中的 DNA 小于 50 ng)，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置 30 min。
(11) 将管放入预加温至 42℃ 的循环水浴中，恰恰放置 90 s，不要摇动管。
热激是一个关键步骤，准确地达到热激温度非常重要。
(12) 快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却 1~2 min。
(13) 每管加 800 μl SOC 培养基，用水浴将培养基加温至 37℃，然后将管转移到摇床上，温育 45 min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。
复苏期中应于 37℃ 温和地摇动细胞（用低于 50 r/min 转速的摇床）。
如果用 α 互补筛选，请接 “用 X-gal 和 IPTG 筛选细菌菌落：α 互补” 铺板。
(14) 将适当体积（每个 90 mm 平板达 200 μl）已转化的感受态细胞转移到含 20 mmol/L MgSO4 和相应抗生素的 SOB 琼脂培养基上。
如果用四环素作为选择标记，全部的转化混合物可以铺在一个单独的平皿上（或软琼脂中），可以先在微量离心机上室温离心 20s 以收集转化菌，加 100 μl SOC 重悬沉淀，轻轻混匀。
重要：玻璃铺菌器需先在乙醇中浸泡，然后在酒精灯上灼烧，待它凉至室温后，才可将转化菌轻轻地铺在琼脂板表面。
如检査氨芐青霉素的抗性，用转化菌铺平板时密度应较低（毎个 90 mm 平板不超过 104 菌落 )，于 37℃ 培养的时间不超过 20 h。氨芐青霉素抗性的转化体可将 β-内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域的青霉素。这样，铺平板时密度过高或培养时间过长都会导致出现对氨芐青霉素敏感的卫星菌落。在选择培养基中不用氨苄青霉素而用羧苄青霉素，以及将抗生素浓度从 60 μg/ml 提高到 100 μg/ml，可使情况有所改善，但不能彻底根除之。抗氨芐青霉素菌落的增加与平皿上所加的细菌数的增加并无线性比例关系，这可能是因为被抗生素杀死的细胞释放生长抑制物质的缘故。
(15) 将平板置于室温直至液体被吸收。
(16) 倒置平皿，于 37℃ 培养，12~16 h 后可出现菌落。
1. 缓冲液和溶液
(1) CaCl2·2H2O ( 1 mol/L)
制备感受态细胞时，取出 10 ml 贮存液加 90 ml 纯水稀释至 100 ml，用预先处理的 Nalgene 滤膜（0.45 μm 孔径）过滤除菌，放置冰上。
或
标准的转化缓冲液（TFB )
对许多大肠杆菌的菌株，用标准 TFB 代替 CaCl2 可获得一致或更好的结果
(2) MgCl2-CaCl2 溶液，冰上预冷。
2. 培养基
(1) LB 或 SOB 培养液（培养最初的细菌生长物）
(2) SOB 琼脂板，含 20 mmol/L MgSO4 和适当的抗生素。
标准的 SOB 琼脂板含 10 mmol/L MgSO4。
(3) SOC 培养液
每个转化反应约需 1 ml。
3. 核酸和寡核苷酸
质粒 DNA ( 重组质粒）
4. 离心机和转头
Sorvall GSA 转头或与之相当的转头
5. 专用设备
(1) 聚丙烯管（50 mm)，冰上领冷
(2) 聚丙烯管（17X100 mm；Falcon 2059)，冰上预冷
(3) 可调至 42℃ 的水浴装置。
二、方法
1. 制备感受态细胞
(1) 从 37℃ 培养 16~20 h 的平板中挑取一个单菌落（直径 2~3 mm)，转到一个含有 100 ml LB 或 SOB 培养基的 1 L 烧瓶中。于 37℃ 剧烈振摇培养 3 h。一般经验，1OD600 约含有大肠杆菌 DH1 109 个/ml。
为达到高效转化，活细胞数务必少于 108 个细胞/ml，对于大多数大肠杆菌来说，这相当于 OD600 值为 0.4 左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔 15~20 min 测定 OD600 值来监测，用监测的时间及 OD600 值列一个图表，以便预测培养物的 OD600 值达到 0.4 的时间，当 OD600 值达到 0.35 时，收获细菌培养物。
在菌株与菌株之间，OD600 值与每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定肠杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的 OD600 值，并将各稀释浓度的培养物铺于无抗生素的 LB 琼脂板以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度计读数得到标准化。
(2) 将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的 50 ml 聚丙烯管中，在冰上放上 10 min，使培养物冷却至 0℃。
(3) 于 4℃ 用 Sorvall GS3 转头（或与之相当的转头）以 4100 r/min 离心 10 min，以回收细胞。
(4) 倒出培养液，将管倒置 1 min 以使最后的痕量培养液流尽。
(5) 每 50 ml 初始培养液用 30 ml 预冷的 0.1 mol/L CaCl2-MgCl2 溶液（80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2 ) 重悬每份细胞沉淀。
(6) 于 4℃ 用 Sorvall GS3 转头（或与之相当的转头）以 4100 r/min 离心 10 min，以回收细胞。
(7) 倒出培养液，将管倒置 1 min 以使最后的痕量培养液流尽。
(8) 每 50 ml 初始培养物用 2 ml 用冰预冷的 0.1 mol/L CaCl2（或 TFB）重悬每份细胞沉淀。
(9) 此时，可以按步骤 10~16 用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于 -70℃。（见 “制备和转化感受态大肠杆菌的 Hanahan 方法 ( 高效的转化策略 )”）。
对大多数大肠杆菌（MC106 除外)，在这一步采用 TFB 代替 CaCl2 可得到相同或更好的结果。
Dagert 和 Ehrlich 的实验（1979 ) 曾表明，细胞可以于 4℃ 在 CaCl2 溶液中保存 24~48 h，在贮存的最初 12~24 h 内，转化率增加 4~6 倍，然后降低到初始水平。
2. 转化
包括阳性和阴性对照。
(10) 用冷却的无菌吸头从每份用 CaCl2 溶液制备的感受态细胞悬液中吸取 200 μl 转移到无菌离心管（17X100 mm）中，每管加入 DNA（用不超过 10 μl 的体积，其中的 DNA 小于 50 ng)，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置 30 min。
(11) 将管放入预加温至 42℃ 的循环水浴中，恰恰放置 90 s，不要摇动管。
热激是一个关键步骤，准确地达到热激温度非常重要。
(12) 快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却 1~2 min。
(13) 每管加 800 μl SOC 培养基，用水浴将培养基加温至 37℃，然后将管转移到摇床上，温育 45 min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。
复苏期中应于 37℃ 温和地摇动细胞（用低于 50 r/min 转速的摇床）。
如果用 α 互补筛选，请接 “用 X-gal 和 IPTG 筛选细菌菌落：α 互补” 铺板。
(14) 将适当体积（每个 90 mm 平板达 200 μl）已转化的感受态细胞转移到含 20 mmol/L MgSO4 和相应抗生素的 SOB 琼脂培养基上。
如果用四环素作为选择标记，全部的转化混合物可以铺在一个单独的平皿上（或软琼脂中），可以先在微量离心机上室温离心 20s 以收集转化菌，加 100 μl SOC 重悬沉淀，轻轻混匀。
重要：玻璃铺菌器需先在乙醇中浸泡，然后在酒精灯上灼烧，待它凉至室温后，才可将转化菌轻轻地铺在琼脂板表面。
如检査氨芐青霉素的抗性，用转化菌铺平板时密度应较低（毎个 90 mm 平板不超过 104 菌落 )，于 37℃ 培养的时间不超过 20 h。氨芐青霉素抗性的转化体可将 β-内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域的青霉素。这样，铺平板时密度过高或培养时间过长都会导致出现对氨芐青霉素敏感的卫星菌落。在选择培养基中不用氨苄青霉素而用羧苄青霉素，以及将抗生素浓度从 60 μg/ml 提高到 100 μg/ml，可使情况有所改善，但不能彻底根除之。抗氨芐青霉素菌落的增加与平皿上所加的细菌数的增加并无线性比例关系，这可能是因为被抗生素杀死的细胞释放生长抑制物质的缘故。
(15) 将平板置于室温直至液体被吸收。
(16) 倒置平皿，于 37℃ 培养，12~16 h 后可出现菌落。
注意事项
本方案的所有操作都必须在无菌条件下进行。
来源：丁香实验
