大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法

常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

转化，是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（ α-互补）。

当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-?-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为α-互补现象。

由互补产生的α－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法：

方法一：

细菌转化的方法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本方法是用冰预冷

CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。本法适用于大多数大肠杆菌菌株，且迅速、重复性好。

实验步骤：

1、 从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH52），或1ml新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约2～3h（旋转摇床200～300r/min），每隔20～30min测量OD600值≈0.4。

2、 在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min。

3、 于4℃用SorvallGS2转头（或与其离心管相配的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。

4、 倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。

5、 以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上。4 h

6、 于4℃用SorvallGS3转头（或与其相应的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。

7、 倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。

8、 每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用。

9、 用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA或连接反应混合物（体积≤10μl，DNA≤50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。

10、 将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上，放置90s～2min，不要摇动试管。

11、 快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。

12、 每离心管加800μlSOC培养基，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。

13、 将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到含200mmol/l MgSO4和相应抗生素的SOB培养基上

14、 将平板置于室温至液体被吸收。

15、 倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。

方法二：

CASsuper One-Step Competent Cell Preps Kit 采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，便于质粒DNA的转化，可满足一般实验的要求。与CaCl2法相比具有多种优点：使用方便，只需一步即可完成感受态细胞的制备；转化效率略高于CaCl2法，一般可达106-108cfu/μg，满足一般实验需要；感受态细胞制成后即可保存于-70℃,无须加入甘油，并且经长期保存活力无明显下降。

1、 从液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌冻存菌，在LB平板上划线，37度过夜至长出单菌落。挑形态饱满的单菌落2个，分别接种5ml LB培养基中，37℃，250rpm， 过夜培养。

2、 次日从5ml LB培养物吸取200μl转入50ml LB培养基中（250ml 锥形瓶），37 ℃，250rpm培养2小时，此时OD600约0.4—0.5。

3、 吸取1ml菌液到1.5ml离心管里，5000rpm离心5分钟，弃去上清。

4、 加入100μl预冷的Solution A，悬浮菌体，冰浴30分钟。

5、 此时感受态细胞已经制成可立即使用或-70℃保存。

注意事项：

1、 所用器具一定要清洁；

2、 操作步骤2 中培养基的装量也是很重要的，建议装量不要高于此值：500ml 锥形 瓶装100ml培养基，250ml锥形瓶装50ml培养基；

3、 在收获菌体前半小时还可以在培养基中加入20mM的MgCl2 ，效果会更好一些；

4、 为保证细胞处于对数生长期，培养后的菌体的OD值不要高于0.6；

5、 制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作； 

6、 细胞转化操作步骤6中也可以不必进行热击，冰浴后直接加入新鲜LB，简化操作步骤，但转化效率低于热击方法，适用于对转化率要求不高的实验。

方法三：

1、 取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。

2、 取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0.3。

3、 然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴10min。

4、 在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液 。

5、 把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中，置冰上30min 。

6、 然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去上清液 。

7、 将菌体悬浮于0.1ml CaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr备用。

方法四：

1、 将1ml过夜培养的细菌（如DH52、TG1、TM101）接种于100ml2×YT培养于500ml烧瓶。于37℃刷烈振荡，通常≥200rpm培养的细菌密度约OD550=0.2～0.5(5×107cells/ml),需2～4h。

2、 将培养物放于冰上致冷10min，于4℃离心细菌培养物，10000rpm离心10min。

3、 弃除上清，将细菌悬浮于原始培养体积的一半（约50ml）的50mMCaCl2和10mm Tris HCl（pH8.0）无菌冷冻液体中。

4、 将细菌悬浮放在冰上约5min，然后将悬浮物于4℃10000/rpm离心10min。

5、 弃上清，悬浮细菌于原始培养体积的1/15的50mMCaCl和10mMTris?HCl（pH8.0）无菌冷冻中。此时的细胞是感受态细胞，即可用于转化。200μl分装于无菌的1.5ml微量离心管中，贮存于-80℃冰箱中。

方法五：TSB法

实验试剂：

1M Mg2+ (1M　MgSO4 和 1M MgCl2等体积混合)，用0.22um滤膜超滤除菌。

TSB液（30mL/ 80mL菌液）（现配现用）： PEG3350 3g ；Tryptone 0.3g ；Yeast extract 0.15g ；NaCl 0.3g ；以上 121℃, 15min 灭菌后，加入1M　Mg2+600uL , 以及DMSO 3mL

实验步骤：

1、 活化菌株 。

2、 挑单菌落培养于5mL　的液笨培养基中。

3、 取液体培养物50uL于80mL的液体培养基中进行扩大培养 。

4、 370C培养3－4小时，OD600在0.4－0.6 。

5、 离心，去上清 。

6、 加入20mLTSB，重悬 。

7、 离心，去上清 。

8、 加入10mLTSB，再加入15－20%的甘油，分装保存。

注：整个操作过程均应在冰上进行。所用药品均需灭菌。

大肠杆菌电转化感受态细胞制备经验过程：

实验步骤：

1、 将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养。

2、 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）。准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用。

3、 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板摇瓶中。

4、 37°C下剧烈振荡培养2-6小时。

5、 定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次） ，当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）。

6、 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天）。

7、 用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。

8、 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。

9、 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。

10、 离心，弃上清液。用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）。

11、 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml。

12、 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存。

转化方法：

1、 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟。

2、 添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟。

3、 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中。

4、 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT 。

5、 对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上）。

6、 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中。

7、 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原。

8、 转移细胞至适当的选择培养基上培养。