大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法

常态的细胞不能摄入外部溶液中的 DNA ,所以要转化质粒DNA进入 大肠杆菌 必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞.受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl,RuCl等化学试剂法）的处理后, 细胞膜 的通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) .

转化,是将异源DNA分子引入一 细胞株 系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程等研究领域的基本实验技术.进入细胞的DNA分子通过复制表达,才能实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状.转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和 甲基化 酶的 突变 株.

α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个 氨基酸 的编码信息,编码α-互补肽,该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（ α-互补）.

当这种载体转入可编码－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时,在异丙基-？-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下,宿主可同时合成这两种肽段,虽然它们各自都没有酶活性,但它们可以融为一体形成具有酶活性的 蛋白质 .所以称这种现象为α-互补现象.

由互补产生的α－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落,所以利用这个特点,在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点,当插入一个外源DNA片段时,会造成LacZ(α)基因的失活,破坏α-互补作用,就不能产生具有活性的酶.所以,有重组质粒的菌落为白色,而没有重组质粒的菌落为蓝色.

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法：

方法一：

细菌 转化的方法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础,其基本方法是用冰预冷CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌,使之进入感受态得以转化.用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞,常用于成批制备感受态细菌.本法适用于大多数大肠杆菌菌株,且迅速、重复性好.

实验步骤：

1、从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH52）,或1ml新鲜的16～20h过夜培养物,转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中.于37℃剧烈振摇培养约2～3h（旋转摇床200～300r/min）,每隔20～30min测量OD600值≈0.4.

2、 在无菌条件下将细菌转移到一个,用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中,在冰上放置10～20min.

3、 于4℃用SorvallGS2转头（或与其离心管相配的转头）以4000r/min离心10min,以回收细胞.

4、 倒数培养液,将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽.

5、 以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀,放于冰上.4 h

6、 于4℃用SorvallGS3转头（或与其相应的转头）以4000r/min离心10min,以回收细胞.

7、 倒出培养液,将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽.

8、 每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定,此时,可以迅速将细胞分装成小份,液氮中冰冻,-70℃贮存备用.

9、 用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中,每管加DNA或连接反应混合物（体积≤10μl,DNA≤50ng）,轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30min.

10、 将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上,放置90s～2min,不要摇动试管.

11、 快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1～2min.

12、 每离心管加800μlSOC培养基,用水浴将培养基加温到37℃,然后将管转移到37℃摇床上,温育45min使细菌复苏,并且表达质粒编码的 抗生素 抗性标记基因.

13、 将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到含200mmol/l MgSO4和相应抗生素的SOB培养基上

14、 将平板置于室温至液体被吸收.

15、 倒置平皿,于37℃培养,12～16h后可出现菌落.