光线对巨噬细胞吸收钙的效果
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美国盖氏与圣汤姆斯医院的内科和牙科学校(盖氏校园)解剖部门的组织修复研究单位与盖氏医院英国伦敦桥，SE1 9RT
利用45Ca放射性元素技术来研究U937细胞受光线照射后钙吸收之效果。当细胞悬浮于磷酸盐缓冲液中时，加以光照处理、能量密度、脉动频率和波长变动的效果加以调查后。结果显示被细胞吸收的钙，取决于光源的能量密度。钙吸收的增加为0~4J/c㎡，但之后当能源密度增加到16J/c㎡，就开始稳定的减少，当能量密度达到最大的测试量32J/c㎡时，所维持的这个水平和控制组的水平并无大差异，也显示钙的吸收取决于频率和波长上。频率测试最有效的范围是16-36.48Hz。波长测试则最有效为660、820和870 nm。细胞内钙的改变标准响应着光照治疗，这也许有相当的 生物 的和临床的重要性，因为钙离子担任许多细胞活动的第二媒介的传达者，包括合成、分泌和细胞内的沟通。 关键词： 45Ca、能量密度、纤维组织母细胞、光线治疗、巨噬细胞、脉波频率、 波长 介绍 从1970年早期，Mester的开创先锋工作开始，低能量的雷射对于 生物 的影响，就已引起广泛的兴趣，雷射特性其中的一种，就是它是同调的，然而，它显示至少某些这种生物效果可经由暴露于不同调的光源之下来产生。2.3雷射和不同调光的治疗功效是引起争议的。4.5问题的来源是缺乏适当控制的实验，及临床的测试，以及缺乏设备的标准化和治疗的制度。即使如此，雷射和光线治疗的机器现在可以在许多物理疗法的部门中发现，而且被例行使用于疼痛纾解和加速组织修复上。就安全和功效上的利益而言，让我们彻底来了解它的生物效果和暴露于光照下的行为机制是非常重要的。 虽然已显示光可以影响从巨噬细胞中释放伤口的介质物，2这些细胞如何透过光能机制调整却从未有完整的说明。许多其它类型的电疗法的显著临床效果，已显示乃是来自于各种离子，像是钙的薄膜渗透性的改变。6细胞质的钙浓度的改变的发生是为了响应外界的各种讯号。这种变动让一个细胞能调适它的活动以响应环境的立即改变。有人提出雷射和非同调光，可能藉由细胞薄膜对于钙离子渗透性的效果而部分的影响巨噬细胞的行为。
方法与材料
细胞培养
类似巨噬细胞线的U-9377繁殖在RPMI 1640中(流体实验室)。培养液使用1%盘尼西林、链霉素(GIBCO)、及10%热钝化小牛胚胎血清(GIBCO)。大约每2天再次培养细胞。细胞在50毫升Nunc培养烧瓶里。每一培养皿有9毫升的培养液与细胞。细胞于5%CO2大气压力、温度37℃下繁殖。每一融合的培养皿大约有9 x 106 细胞数量 钙的吸收 同位素45Ca(Amersham国际股份有限公司)是取自于钙氯化物的水溶液。其特定的活动是2 mG/ml(1.62 mg/ml钙) 。巨噬细胞被加在包含45Ca浓度1uCi/ml磷酸盐缓冲培养液中。细胞的密度是1X106ml。细胞的旋浮物接着转移到消毒过的1ml容量之24个来源培养皿(流体)。 之后每一个器皿，暴露于使用生物疗法3ML装置(Omega全球科技)或者同调或不同调的光照射下。物理的参数如下：主动媒介—砷铝化镓(GaAlAs)；点的大小为1cm距离，0.125c㎡； 100%密度光谱频宽(15mW)-5nm(不同调光源)，0.01mm(同调光源)；脉冲宽18µs，全分散角度-10°(非同调光源)，23°平行到接合点平面，和16°垂直接合点平面(同调光源)。 能源密度调查 波长-660nm (N) *；脉频-5000Hz；平均能量输出-15mW；能源密度0,2,4,8,16,或32 J/c㎡；能量密度-120mW/c㎡。 脉频调查 波长-660nm(N)；脉频--2.28, 4.56, 16, 36.48, 700或5000Hz；平均能量输输出--15mW；能源密度--2 J/c㎡；能量密度--120mW/c㎡。 波长调查 波长-660(N)，820(C~undefined，870(N)或880(N) ；脉频-5000Hz；平均能量输出-15mW；能源密度-2 J/c㎡；能量密度-120mW/c㎡。~AN~B~L_非同调；(C)= 同调。 脉频和波长的调查，选择能源密度2 J/c㎡，因为它在Mester等人1的指定范围之内，就某些细胞行为的观点上，具有刺激的效果，在能源密度和脉频的调查上，使用660nm波长因为发现它能最有效的刺激巨噬细胞分泌的活动。2在脉频的调查研究中，所有可设定于生物治疗法3ML雷射上的频率都被加以测试。光源藉由Photodyne平面反应能量计(PX16E) 加以校准。
每个培养皿的细胞和培养液暴露于位于培养细胞表面上方1cm的光源下或给予假照射。每种暴露的情况重复进行6次。
照射之后经过五分钟，将细胞以1000rpm离心旋转一分钟。细胞在磷酸盐缓冲液(PBS) 中，用重新悬浮与离心力冲洗一次，也在EDTA(0.1%W/V) 中冲洗一次。细胞之后在0.1ml的 蒸馏 水中重新悬浮。然后将100ul容量的细胞悬浮加到包含4ml的光相安全闪烁液体(LKB) 的塑料玻璃瓶。然后利用Packard三倍的碳酸液体闪烁计数器，来分析每一个玻璃瓶45Ca的活动约十分钟的时间。 统计分析 每个实验群组和假的照射群组，利用Student氏的配对t检定加以比较。 结果 能源密度调查 结果以图形显示于图1，在所测试范围中，45Ca剌激的最大值出现于吸收能源密度范围4-8J/c㎡。这些水平都显著的和控制组不同(p<0.01) 。4-8J/c㎡的刺激显著大于2 J/c㎡(p<0.05) 。在8 J/c㎡以上的能源密度，45Ca的吸收减少到和控制组假照射水平无差异的阶段。 频率调查 结果以图形表示在图2，在所测试范围中，所有频率都可增加45Ca的吸收至在控制组水平以上(p<0.01))，最有效的频率是16Hz，产生的增加显著大于4.56, 700和5000Hz(p<0.01)。 波长调查 结果以图形显示于图3，在所测试范围中，660, 820和870 nm增加45Ca的吸收达控制组水平之上(p<0.01)，然而，在这三个波长有显著的差异 (p<0.05)，暴露于880 nm细胞的45Ca水平则和那些控制组水平无显著差异。 讨论细胞对钙的每分钟浓度的改变极为敏感。在细胞之外的钙浓度大约比细胞溶质13大10000倍。这个浓度差异是藉细胞薄膜对钙的相对不渗透性，和位在细胞薄膜中钙的抽取活动来维持。当一个细胞经由外在的讯号而受刺激，钙的流入可以暂时增加到正常速率的4倍。当细胞溶质中的钙水平提高，特定蛋白质如携钙素和离子结合会有增加。携钙素与钙的结合引起蛋白质结构的改变。这种结构的改变，让细胞中的钙和携钙素复合物与其它蛋白质交互作用并改变其功能活动。如果外部的刺激被移除则钙流入率降低，造成细胞中钙的减少进而刺激已结合的钙，从结合的蛋白质中分离，所以原始的构造被回复而系统停止。因此，细胞内的钙浓度改变可以作为启动与停止的开关。
在这项研究中，45Ca的测量显示光照治疗可以剌激离子流进U937细胞。虽然不确定这如何达成，这可能是细胞薄膜的直接改变导致其更能让离子渗透所致。另外，光能源可能被位在粒线体的内在薄膜的呼吸炼组件吸收。这可能引起呼吸组件和NAD群的氧化作用的暂时活化，进而引起粒线体和细胞质氧化还原状态的改变。结果造成ATP群和细胞质H+浓度的增加。细胞质pH值的改变可能导致细胞薄膜对各种离子，像是钙渗透性的改变而会改变细胞的活动。3
U937细胞对雷射的反应仰赖于能源密度、频率和波长。在所测试能源密度范围，似乎有一窗口的存在，最有效的能源密度是4和8J/c㎡。这个范围以下和以上，45Ca流入的效果就降低了。此窄窗的存在可以部分解释治疗师使用雷射所获得响应的多样性，只有那些落在有效范围内的治疗可以达到成功的结果。 不只是雷射的交互作用透过能源密度窗口运作，它也显示频率的窗口，最高的反应在16Hz。能源密度和频率窗口在其它细胞暴露在电疗放射的效果也有报导，例如：极低频的磁场9, 10，Blackmam和其它人11报告，当暴露于16Hz 交流电磁场中，在隔离的小鸡脑中的钙离子活动会被加强。频率1、30和32 Hz则是没有效的。这显示出响应磁场的离子活动可由粒子回旋加速器共振理论12来预测，描述生物的效果，依所涉及的粒子之物质与电荷，以及磁场的力量只在的特定频率附近发生。在磁场治疗和光线疗法中频率窗口的存在，显示两者包含相似的机能。每个似乎都可以操作钙的启动机制，控制细胞的主要活动。这表示据报从光照巨噬细胞所释出的增加因子，可经由钙的启动机制加以传达。
能量密度：2 J/c㎡
波长：660 nm
图2：频率 vs. 每分钟衰退期之图示。 显著大于控制组(p<0.01)
能量密度：2 J/c㎡
频率：5000 Hz
图3：波长vs. 每分钟衰退期之图示。 显著大于控制组(p<0.01)
