挽救细胞污染效果评价:巨噬细胞法效果颇尴尬
北方同正
自建人喉癌细胞系 LSC-1 传至第 12 代以后, 细胞生长速度变慢, 已贴壁细胞变圆、漂起、死亡, 细胞间隙出现可运动的微小生物, 但培养液依然清亮不浑浊, 收取上清液离心, 将沉淀物行常规血琼脂培养, 24 h 结果为无菌生长, 培养 5~7 d 后开始出现灰白色细小菌落, 光滑湿润, 有透明溶血环,。
全自动细菌鉴定仪生化鉴定条检测为嗜麦芽寡养食单胞菌 (Stenotrophomonasmaltophilia), 该菌为非发酵革兰阴性杆菌。细菌药敏结果: 在 15 种抗生素中, 该菌仅对头孢他啶、哌啦西林、头孢哌酮/舒巴坦 3 种药物敏感,其余均耐药。
经筛选, LSC-1 细胞可耐受的抗生素最佳抑菌浓度分别为: 哌啦西林 64 mg /L、头孢他啶 2 mg /L、头孢哌酮/舒巴坦 32 mg /L。LSC-1 细胞在哌啦西林和头孢他啶最佳抑菌浓度中分别传代一次, 在头孢哌酮/舒巴坦中传代 3 次, 并每种细胞各冻存 3 株。
复苏情况: 哌啦西林 3 株均未贴壁, 头孢他啶两株复苏后贴壁, 但生长一周后均出现细菌, 细胞死亡; 另一株第二次冻存, 再次复苏后生长良好, 但抗生素撤离后出现细菌, 经鉴定仍为嗜麦芽寡养食单胞菌。
头孢哌酮/舒巴坦 3 株复苏后均能存活, 但生长缓慢, 一周传代一次, 仍有少量细菌, 抗生素撤离后重又出现细菌污染。在 3 种抗生素中, 头孢哌酮/舒巴坦抗菌作用和细胞生长状态最好, 头孢他啶对细胞损伤较大, 细胞表面粗糙, 状态较差。
比较头孢哌酮/舒巴坦和巨噬细胞先后使用和二者交替使用的除菌效果, 并观察细胞冻存复苏后的传代次数, 具体方法为: 头孢哌酮/舒巴坦 32 mg /L 培养 1 次、2 次、4 次后, 再分别与巨噬细胞共培养 2 次, 各冻存 1 株; 头孢哌酮/舒巴坦和巨噬细胞交替培养 3 次, 冻存 1 株。
复苏后细胞状态: 头孢哌酮/舒巴坦和巨噬细胞依次使用者中, 抗生素使用次数较多的细胞传代次数较多 (5 代); 二者交替使用的细胞状态更好于前 3 株细胞, 且传代次数也最多 (6 代)。然而所有细胞最终因状态不佳或污染重现而死亡。
挽救污染细胞的方法有抗生素除菌法、巨噬细胞吞噬法和动物接种除菌法, 其中较常使用的是抗生素冲击法。清除效果的检验应包括无菌检验和细胞性状评估。无菌检验指细胞在无抗生素培养基中传代 3~4 次, 显微镜下观察无细菌、培养上清细菌无菌生长, 方可确定污染细菌被消除干净。
细胞的组织来源鉴定和染色体分析是细胞系鉴定的两个主要方面。LSC-1 为喉鳞状上皮来源细胞系, 参照相关文献, 我们选用角蛋白免疫组织化学鉴定和细胞周期 DNA 倍体分析方法评估细胞性状。
细胞系中麦芽窄食单胞菌有可能来源于标本本身。由于该菌对氨基糖甙类和很多 B-内酰胺类 (包括碳青霉烯类) 天然耐药, 故常规培养液中的青、链霉素不能完全抑制其生长。有研究显示, 该菌仅对少数几种抗生素如头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶等耐药性较低, 本文得到了相同的结果。
本实验采用 15 种抗生素对该菌的抑菌效果进行测定, 找出其中有效的 3 种, 又分别对这 3 种抗生素的 6 个梯度浓度测试, 最后确定抗菌效果最好、细胞毒性最小浓度为 32 mg /L 头孢哌酮/舒巴坦, 其作用能控制细菌生长并使细胞传代 2~3 代, 当联合使用小鼠巨噬细胞后又使细胞传代次数增加到 5~6 代。然而, 抗生素的作用主要是通过抑制细菌细胞壁的合成达到抑制细菌生长的效果 , 并不能直接杀死细菌。
有研究表明, 单独使用抗生素处理细菌污染的 KB 口腔上皮样癌细胞系, 不能完全清除细胞内的细菌。
巨噬细胞在体外没有其他免疫细胞和抗体等因素的参与下 , 其吞噬功能是有限的 , 在这里仅起到辅助抗生素的作用, (相关的报道有用于挽救支原体污染的细胞, 但体外抗细菌的作用尚未见报道), 故当抗生素撤离后以上 2 种方法处理的细胞中细菌再次出现。 另外 , 抗生素对培养细胞的形态和性状都有一定的影响。
本实验有效的 3 种抗生素中, 头孢他啶毒性最大, 头孢哌酮/舒巴坦虽然毒性相对弱一些, 但也使喉癌细胞角蛋白 AE1 /AE3 表达有所减少、DNA 倍体分析原有的异倍体细胞消失, 接种裸鼠后不能成瘤。
因此可以认为, 有针对性地使用抗生素或许可以短期控制住细胞系中污染细菌生长, 但同时可能伴随有细胞生物学特性变化。进而推论, 抗生素冲击法也难控制细菌再次暴发性生长 , 而且对细胞更有损伤。至于那些不做污染菌的分离和鉴定、仅靠单一某种广谱抗生素来对付所有污染细菌, 或是仅参照临床用药剂量来设计抗生素浓度等做法更不可取。
动物体内接种除菌法是利用动物的免疫系统来消灭污染微生物的方法。常用的动物裸鼠是先天性胸腺缺陷的突变小鼠, 其 T 细胞缺如致使特异性细胞免疫功能丧失, 但 B 细胞功能依然正常以及非特异性细胞免疫系统 NK 细胞活力强, 故可用于肿瘤细胞的污染清除。
细菌在裸鼠体内可被巨噬细胞和中性粒细胞吞噬、NK 细胞杀灭、IgM、IgG 类抗体结合病菌后激活补体杀死或溶解等。本实验结果显示, 接种 BALB /c-nu 裸鼠之后的 LSC-1 细胞形态良好、生长旺盛 , 细胞间没有细小微生物 , 传代多达 8 次后 , 细胞冻存和复苏仍能正常生长 , 并在抗生素撤离后细胞生长状态不变 , 细菌培养为阴性。
细胞生物学特性上, 细胞角蛋白阳性表达比例较高, 与第 3 代 LSC-1 接近, 保持了原有上皮来源的性质, 组织病理学观察仍具有高度的异型性及肿瘤细胞的特征, 细胞倍体及增殖周期分析结果显示异倍体细胞及 S 期细胞的比例与第 3 代细胞相同。
实验表明 , 利用裸鼠去除肿瘤细胞系中的污染细菌是最为理想的方法 , 既能彻底清除污染细菌 , 又能保持肿瘤细胞的来源特征和恶性特性。