病原微生物染色法

在组织切片上，显示细菌最常用的染色法是Gram氏染色法，依据染色性状不同，把细菌分为两大类，Gram氏阳性细菌和Gram氏阴性细菌。
分枝杆菌有脂性被膜，用Gram氏染色法染色一般不易着色。为了显示这类杆菌，齐一尼氏石碳酸复红是最常用的经典染色方法。杆菌着色后，具有抗盐酸酒精的脱色作用，故又称抗酸性杆菌，这类细菌在病理学检验中最多见的是结核杆菌和麻疯杆菌。
结核杆菌呈单个或平行聚合排列。
麻疯杆菌与结核杆菌相似，但较短粗。
螺旋体染色目前仍使用经典的Levaditi氏组织块银染法染色。石蜡切片染色则采用Wartrin Starry氏法。
大部分霉菌虽可在HE染色切片中显示出来，但有些则需特殊染色法。如用P.A.S显示白色念球菌，新型隐球菌用Crocott-Gomori氏六胺银法。
一、Gram氏染色法
操作方法：
（1）切片常规脱蜡至水。
（2）结晶紫液中染45秒。
（3）自来水洗。
（4）Gram氏碘1分钟。
（5）在碘丙酮中分化(直到切片无色为止)。
（6）水冲洗。
（7）1%中性红染核1分钟。
（8）自来水速洗。
常规脱水、透明、封固。
结果：Gram氏阳性菌呈蓝黑色，Gram氏阴性菌呈红色。
Gram氏 试剂 配制。
1．结晶紫染液(Lillie氏)
95%酒精 20ml
结晶紫 2g
草酸铵 1g
蒸馏水 80ml
2．Gram氏碘液
碘结晶 1g
碘化钾 2g
蒸馏水 300ml
3．碘丙酮溶液
Lugot氏碘 2ml
丙酮 98ml
Gram氏切片染色(改良法)
操作方法：
（1）石蜡切片脱蜡常规至水。
（2）HE水溶液染色，伊红较正常深。
（3）1%结晶紫滴于切片染5-10分钟。
（4）倾去染液加Lugol氏碘液5-10分钟。
（5）倾去碘液，滤纸稍印干。
（6）苯胺二甲苯(1:1)分化至无色。
（7）二甲苯洗2次。
（8）二甲苯透明、树胶封固。
结果：Gram阳性细菌及纤维素亮蓝色，核兰色，背景淡红色。
试剂 配制：
1．1%龙胆紫或甲紫、结晶紫水溶液。
2．Lugol氏碘液。

二、齐一尼氏抗酸杆菌染色法(Zienl-Neelson)
齐一尼氏抗酸杆菌染色法是一种传统的经典抗酸染色法，常用来显示结核杆菌、麻疯杆菌。由于染液的加温，可使石碳酸复红进入分枝杆菌内。再用稀酸脱去背景上的多余红色，如用苏木素来染核，杆菌鲜红色对此清晰。
操作方法：
（1）切片常规脱蜡。
（2）石碳酸复红染液滴于切片上，置酒精灯上，徐徐加温，使出现蒸气约5分钟(或在60℃下染30分钟)冷却2分钟。
（3）水洗。
（4）1%盐酸酒精分化，切片呈淡桃红色为止(在显微镜下控制)。
（5）流水洗。
（6）苏木素或0.5%次甲蓝水溶液染核。
（7）常规脱水、透明、封固。
结果：抗酸菌红色，核蓝色。
试剂配制：
Ziehl-Neelsony氏石碳酸复染液。
碱性品红酒精饱和液(约5.95%) 10ml
5%石碳酸水溶液 90ml

三、抗酸杆菌的荧光法
在组织切片中大量的抗酸杆菌易于见到，少量时则难于寻找，用荧光法则比齐一尼氏染色易于找到。
操作方法：
⑴切片置入二甲苯，(1份花生油+2份二甲苯更好)脱蜡至水。
⑵在金胺，若丹明溶液中10分钟(60℃)。
⑶自来水洗。
⑷盐酸酒精分化2分钟。
⑸自来水洗。
⑹0.5%高锰酸钾液中2分钟。
⑺自来水速洗。
⑻吸水纸吸干。
⑼急速入80%酒精洗。
⑽吸水纸吸干。
⑾纯酒精。
⑿二甲苯透明，用荧光封固剂或DPX及中性树胶封固。
结果：抗酸杆菌一明亮的黄色荧光，背景不染色。
试剂配制：
金胺O(Auramino O) 1.5g
若丹明B(Rh oolamlire B) 0.75g
甘油 75ml
酚结晶(50℃液化) 10ml
蒸馏 水 50ml

四、梅毒螺旋体染色法
Levediti氏组织块整体染色法
（1）切取2-4mm厚的组织块在10%福尔马林中固定24小时。
（2）流水冲洗。
（3）95%酒精24小时。
（4） 蒸馏 水洗至组织下沉为止。
（5）2%硝酸银溶液(暗处)每日换一次，3-4天。
（6）置于焦性没食子酸—福尔马林还原剂1-2天(焦性没食子酸4克，福尔马林5ml加水至100ml)。
（7）洗于蒸馏水。
（8）石蜡切片5微米，脱蜡、封固。
结果：螺旋体黑色，背景竭色。

五、铬酸P、A、S(真菌类染色)
⑴石蜡切片2-3微米，脱腊常规至水。
⑵4%铬酸氧化1小时。
⑶流水冲洗5分钟，蒸馏水洗2分钟。
⑷冷雪夫氏(Cold Sohiff)液，15-20分钟。
⑸0.5%偏重亚硫酸钠水溶液5分钟(更换2次)。
⑹水洗5分钟。
⑺蒸馏水洗，至70%酒精洗2分钟。
⑻醛复红染液30分钟。
⑼95%酒精洗(洗去多余染料)。
⑽蒸馏水洗，入淡绿染液30秒钟。
⑾蒸馏水速洗(镜下观察)。
⑿曲霉菌、念球菌属、细胞浆菌属、隐球菌属为红紫色。曲霉菌丝周边紫红色，弹力纤维紫色，背景绿色。

六、病毒包涵体染色法
1、Mann氏甲基蓝伊红染色法
Mann氏甲基蓝伊红染色法，是一种病毒包涵体的染色法，在HE染色切片上包涵体就能显示出来，用这一染色法则更清楚。
操作方法：
（1）切片脱蜡至水。
（2）用Mann氏染液染色8-24小时(染液要新配制)。
（3）蒸馏水洗。
（4）用碱性酒精分化(40%氢氧化钠2-3滴，无水酒精100ml)约30秒钟。
（5）两酮速脱水。
（6）二甲苯透明、封固。
结果：Negri氏小体红色。
试剂配制：
Mann氏染液。
1%甲基兰水溶液 6ml
1%伊红水溶液 6ml
蒸馏水 28ml

2、Nacchiavello氏染色
（1）切片脱蜡至水。
（2）以0.25%碱性品红水溶液染色30分钟。
（3）用0.5%柠檬酸分化约3秒钟。
（4）自来水洗。
（5）用1%亚甲兰作对比染色15-30分钟。
（6）水洗。
（7）脱水、透明、封固。
结果：包涵体、立克次氏体均染红色，其余组织呈蓝色。