体液样本游离核酸/病原微生物核酸提取

游离核酸（包括 cfDNA 和 cfRNA) 是指在生物体液中发现的游离于细胞外的核酸，游离核酸的来源分为内源性和外源性，可以是细胞凋亡释放到体液中的内源性核酸，也可以是人体感染病原微生物后由微生物产生的外源性核酸。游离核酸可以用于癌症的早期诊断、预后评估，也可以用于病原感染的诊断，根据实验目的不同，采集体液样本类型不同，核酸纯化方案也有一定区别。

体液样本先经过高速离心去除细胞及细胞碎片等大分子物质，进行蛋白消化后，将核酸溶液转移到硅胶膜柱上使核酸结合在柱膜上，经洗涤去除杂质后洗脱得到纯净的核酸。

由于游离核酸浓度较低，可以在缓冲液中加入 carrier RNA 去除静电效应，保证核酸更好地吸附到纯化柱上，提高洗脱效率。

QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN，用于病原微生物核酸提取，下文操作步骤基于此试剂盒)

QIAamp Circulating Nucleic Acid (QIAGEN，用于体液游离核酸提取)

离心机

加热模块或水浴锅

1.5 ml 或 2 ml 离心管、无菌吸头

一次性手套

乙醇（96%–100%）

1. 吸取 560 μl  准备好的 Buffer AVL–carrier RNA 至 1.5 ml 的离心管。

2. 加 140 μl 血浆、血清、尿液、细胞培养上清液，或其他无细胞体液至第 1 步准备好的管中。涡旋振荡 15 s。为了保证裂解效率，请确保样本与 Buffer AVL 彻底混匀为匀浆。只冻融过 1 次的冰冻样本也可被处理。如样本是拭子，请按照以下步骤处理：拭子置于离心管中，加入 400 μl Buffer ATL 浸润样本；56°C 振荡孵育 15 min；吸取 140 μl 样本加入第 1 步准备好的离心管

3. 室温下（15°C–25°C）孵育 10 min。病毒颗粒在室温下 10 min 后充分裂解。长时间的孵育无助于 RNA 的产量和质量。

4. 快速离心以去除附着于内壁与内盖的水滴。

5. 加 560 μl 乙醇（96%–100%）至样本中，短暂离心 15 s 混匀。混匀后，快速离心去除附着于内壁与内盖的水滴。

6. 小心吸取 630μl 第 5 步获的溶液至 QIAamp Mini column 上（柱子放置于 1 个 2 毫升的收集管内）。盖上盖子，6000 x g (8000 rpm）下离心 1 min。将 QIAamp Mini column 移至 1 个新的 2 ml 收集管，丢弃带有流出液的旧管。离心建议程序：6000 x g (8000 rpm）下离心 1 min。

7. 小心打开盖子，重复第 6 步操作。

8. 小心打开盖子，加入 500 μl Buffer AW1。盖上盖子，6000 x g (8000 rpm）下离心 1 min。将 QIAamp Mini column 移至 1 个新的 2 ml 收集管，丢弃带有流出液的旧管。

9. 小心打开盖子，加入 500 μl Buffer AW2。盖上盖子全速离心（20,000 x g; 14,000 rpm) 3 min。直接进行第 11 步，或为了排除 Buffer AW2 的残留机会，先进行第 10 步操作，再做第 11 步。

10. 将柱子放在一个新的 2 ml 收集管，丢到含有流出液的旧管。全速离心 1 min。

11. 将柱子放在 1 个干净的 1.5 ml 的离心管，丢掉含有流出液的旧管。小心打开盖子，加 60 μl  平衡好的 Buffer AVE 至膜上。盖上盖子，室温下孵育 1 min。6000x g (8000 rpm）离心 1 min。RNA 在–20°C 或–70°C 下可以稳定保存至多 1 年。

1.  游离核酸提取过程中，样本收集和离心后，血浆（未经处理，或用肝素之外的抗凝剂处理）或血清可在 2°C–8°C 下储存至多 6 h。如需长期保存，建议分装后在–20°C 或 –80°C 保存。冷冻血浆或血清样本不可反复冻融。反复冻融将会促使蛋白变性沉淀，降低核酸回收率。

2.  如果体液样本需要长时间保持运输，需要使用专门的游离核酸采血管，常规的肝素、ETDA、枸橼酸钠采血管无法有效防止溶血，gDNA 会污染游离核酸。

3. cfDNA 的浓度常常很低，Qubit 定量可能无法检测到信号，且核酸处于片段化状态，您需要高灵敏度且可靠的工具才能确保检测到信号的准确性。

4.  单次 60 μl Buffer AVE 处理 QIAamp Mini column 可以达到至少 90% 的病毒 RNA 洗提效率。2 次 40 μl Buffer AVE 洗提可以提高 10% 的产量。洗提体积小于 30 μl 会减少产量，也不会增加最终洗提液中 RNA 的浓度。

内容来源：QIAGEN  凯杰