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病原微生物检测实验

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一、原理
菌落总数:指在一定条件下(如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等)每克(每毫升)检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定,即在需氧情况下,37℃培养48h,能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数,所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌,由于现有条件不能满足其生理需求,故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数,菌落总数并不能区分其中细菌的种类,所以有时被称为杂菌数,需氧菌数等。
大肠菌群:指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
人沙门氏菌病有四类综合症:沙门氏菌病;伤寒;非伤寒型沙门氏菌败血症和无症状带菌者。沙门氏菌胃肠炎是由除伤寒沙门氏菌外任何一型沙门氏菌而所致,通常表现为轻度,持久性腹泻。伤寒实际上是由伤寒沙门氏菌所致。未接受过治疗的病人致死率可超过10%,而对经过适当医疗的病人其致死率低于1%,幸存者可变成慢性无症状沙门氏菌携带者。这些无症状携带者不显示发病症状仍能将微生物传染给其他人(传统的例子就是玛丽伤寒)。
沙门氏菌胃肠炎,潜伏期一般6-72小时,主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤头痛。病程一般1-2天或更长。感染剂量为15-20个菌,死亡率达1-4%。最易感群体是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。污染源主要是人和家畜的粪便,沙门氏菌常存在于动物中,特别是禽类和猪。在许多环境中也有存在。从水,土壤,昆虫中,从工厂和厨房设施的表面和动物粪便中已发现该类细菌。它们可以存在于多类食品中,包括生肉,禽,奶制品和蛋,鱼,虾和田鸡腿,酵母,椰子,酱油和沙拉调料,蛋糕粉,奶油夹心甜点,顶端配料,干明胶,花生露,橙汁,可可和巧克力。 
沙门氏菌属也是嗜温性细菌,在中等温度,中性pH,低盐和高水活度条件下生长最佳。生长最低水活度为0.94。兼性厌氧,对中等加热敏感。同样,该菌属能适应酸性环境。通过卫生以防止二次污染;蒸煮;巴氏消毒等控制。正常家庭烹调,个人卫生可以防止煮熟食品的二次污染,以及控制时间和温度一般都能充分防止沙门氏菌病的发生。

二、目的
1.了解大肠菌群作卫生指标原因及检测原理、菌种鉴定原理。
2.正确测定食品中细菌总数和大肠菌群数,会从EMB平板上区分大肠菌群。
3.了解食品中和食物中毒样品中沙门氏菌的检验

三、 仪器 和材料
1.溶液或试剂
2.样品:水样、饮料等
3.培养基:具体见附录1
4. 仪器 或其它用具灭菌三角烧瓶,灭菌培养皿,灭菌吸管,灭菌试管无菌三角玻棒、
记号笔,接种环、试管架、酒精灯、火柴、标签纸等。

四、实验内容与方法
(一)样品的采集和处理
1.自来水水样
先冲洗水龙头,用酒精灯灼烧龙头,放水5-10min,在酒精灯旁打开水样瓶盖(或棉花塞),取所需的水量后盖上瓶盖(或棉塞),迅速送回实验室检验,若来不及检验放在4℃冰箱内保存,24h内检验。
经氯处理的水中含余氯,会减少水中细菌的数目,采样瓶在灭菌前加入硫代硫酸钠,以便取样时消除氯的作用。硫代硫酸钠的用量视采样瓶的大小而定。若是500mL的采样瓶,加入1.5%的硫代硫酸钠溶液1.5mL(可消除余氯量为2mg/L的450mL水样中全部氯量。
2.河湖、井水、海水
用特制的采样瓶采集水样,若是测定好氧微 生物 ,应立即改换无菌棉花塞。迅速送回实验室检验,若来不及检验放在4℃冰箱内保存,24h内检验,污水要在6h以内结束检验。
3.蛋类
液全蛋(均状):无菌操作称25g置于无菌的500mL锥形烧瓶或其它合适容器中。加225mL胰胳胨(胰化物)大豆肉汤(TSB)并振荡充分混匀。在室温下静置60分钟,振摇使其充分混匀,用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2,置35℃培养24±2小时。
4.液奶(去脂牛奶,含2%脂肪牛奶,全脂奶,和脱脂奶)
无菌操作称取25g或者吸取25mL样品,放入灭菌带螺旋帽的广口瓶中(500mL)或其他合适的容器内。振摇使充分混匀,用试纸测定pH值。必要时用灭菌的1NNaOH或1NHcl调节pH至6.8±0.2。在测定最终pH前要盖紧瓶盖并充分混匀。
(二)菌落总数的测定
检样→做成几个适当倍数的稀释度→选择2个~3个适宜稀释度各取1mL分别加入灭菌培养皿中→每皿内加入适量营养琼脂(36℃±1℃,48h±2h)→菌落计数→报告
(三)多管发酵法测定大肠菌群
1.初发酵试验
在3根含有10ml单倍的乳糖蛋白胨发酵试管中各加入样品0.1ml,在3根含有10ml单倍的乳糖蛋白胨发酵试管中各加入样品1ml,在3根含有10ml双倍浓缩(或者5ml三倍浓缩)的乳糖蛋白胨发酵试管中各加入样品10ml(如图所示)。混匀后,37℃培养24h,24h未产气的继续培养至48h。
2.EMB平板分离
经24h培养后,将产酸产气及48h产酸产气的发酵管,分别划线接种于伊红美兰琼脂平板上,再于37℃培养18~24h,将符合下列特征的菌落的一小部分,进行涂片,革兰氏染色,镜检。

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