病原微生物检测实验

一、原理
菌落总数：指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
大肠菌群：指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中大肠菌群数系以100ml（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN)表示。
人沙门氏菌病有四类综合症：沙门氏菌病；伤寒；非伤寒型沙门氏菌败血症和无症状带菌者。沙门氏菌胃肠炎是由除伤寒沙门氏菌外任何一型沙门氏菌而所致，通常表现为轻度，持久性腹泻。伤寒实际上是由伤寒沙门氏菌所致。未接受过治疗的病人致死率可超过10%，而对经过适当医疗的病人其致死率低于1%，幸存者可变成慢性无症状沙门氏菌携带者。这些无症状携带者不显示发病症状仍能将微生物传染给其他人(传统的例子就是玛丽伤寒)。
沙门氏菌胃肠炎，潜伏期一般6-72小时，主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤头痛。病程一般1-2天或更长。感染剂量为15-20个菌，死亡率达1-4%。最易感群体是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。污染源主要是人和家畜的粪便，沙门氏菌常存在于动物中，特别是禽类和猪。在许多环境中也有存在。从水，土壤，昆虫中，从工厂和厨房设施的表面和动物粪便中已发现该类细菌。它们可以存在于多类食品中，包括生肉，禽，奶制品和蛋，鱼，虾和田鸡腿，酵母，椰子，酱油和沙拉调料，蛋糕粉，奶油夹心甜点，顶端配料，干明胶，花生露，橙汁，可可和巧克力。　
沙门氏菌属也是嗜温性细菌，在中等温度，中性pH，低盐和高水活度条件下生长最佳。生长最低水活度为0.94。兼性厌氧，对中等加热敏感。同样，该菌属能适应酸性环境。通过卫生以防止二次污染；蒸煮；巴氏消毒等控制。正常家庭烹调，个人卫生可以防止煮熟食品的二次污染，以及控制时间和温度一般都能充分防止沙门氏菌病的发生。

二、目的
1.了解大肠菌群作卫生指标原因及检测原理、菌种鉴定原理。
2.正确测定食品中细菌总数和大肠菌群数，会从EMB平板上区分大肠菌群。
3.了解食品中和食物中毒样品中沙门氏菌的检验

三、 仪器 和材料
1.溶液或试剂
2.样品：水样、饮料等
3.培养基：具体见附录1
4. 仪器 或其它用具灭菌三角烧瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管无菌三角玻棒、
记号笔，接种环、试管架、酒精灯、火柴、标签纸等。

四、实验内容与方法
（一）样品的采集和处理
1.自来水水样
先冲洗水龙头，用酒精灯灼烧龙头，放水5－10min，在酒精灯旁打开水样瓶盖（或棉花塞），取所需的水量后盖上瓶盖（或棉塞），迅速送回实验室检验，若来不及检验放在4℃冰箱内保存，24h内检验。
经氯处理的水中含余氯，会减少水中细菌的数目，采样瓶在灭菌前加入硫代硫酸钠，以便取样时消除氯的作用。硫代硫酸钠的用量视采样瓶的大小而定。若是500mL的采样瓶，加入1.5％的硫代硫酸钠溶液1.5mL（可消除余氯量为2mg/L的450mL水样中全部氯量。
2.河湖、井水、海水
用特制的采样瓶采集水样，若是测定好氧微 生物 ，应立即改换无菌棉花塞。迅速送回实验室检验，若来不及检验放在4℃冰箱内保存，24h内检验，污水要在6h以内结束检验。
3.蛋类
液全蛋（均状）：无菌操作称25g置于无菌的500mL锥形烧瓶或其它合适容器中。加225mL胰胳胨（胰化物）大豆肉汤（TSB）并振荡充分混匀。在室温下静置60分钟，振摇使其充分混匀，用试纸测定pH值。必要时调节pH值至6.8±0.2，置35℃培养24±2小时。
4.液奶（去脂牛奶，含2%脂肪牛奶，全脂奶，和脱脂奶）
无菌操作称取25g或者吸取25mL样品，放入灭菌带螺旋帽的广口瓶中（500mL）或其他合适的容器内。振摇使充分混匀，用试纸测定pH值。必要时用灭菌的1NNaOH或1NHcl调节pH至6.8±0.2。在测定最终pH前要盖紧瓶盖并充分混匀。
（二）菌落总数的测定
检样→做成几个适当倍数的稀释度→选择2个~3个适宜稀释度各取1mL分别加入灭菌培养皿中→每皿内加入适量营养琼脂（36℃±1℃，48h±2h）→菌落计数→报告
（三）多管发酵法测定大肠菌群
1.初发酵试验
在3根含有10ml单倍的乳糖蛋白胨发酵试管中各加入样品0.1ml，在3根含有10ml单倍的乳糖蛋白胨发酵试管中各加入样品1ml，在3根含有10ml双倍浓缩（或者5ml三倍浓缩）的乳糖蛋白胨发酵试管中各加入样品10ml（如图所示）。混匀后，37℃培养24h，24h未产气的继续培养至48h。
2.EMB平板分离
经24h培养后，将产酸产气及48h产酸产气的发酵管，分别划线接种于伊红美兰琼脂平板上，再于37℃培养18~24h，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。