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血浆中C5a的ELISA测定

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一、实验原理
将抗C5a单克隆抗体包被固相聚苯乙烯板,加入经聚乙二醇(PEG)处理的待测样本,然后依次加入兔抗人C5a-IgC多克隆抗体和过氧化物酶标记的猪抗兔IsC,再加入底物2,2’-连氮-双(3-乙基苯骈唑啉-6-磺酸盐)(ABTS)和H2O2显色,于酶标仪405 mn处测定每分钟光密度增加量(OD/min),以OD/min为纵坐标,C5a标准晶浓度为横坐标绘制标准曲线图,求出待测样本中C5a的含量。
二、实验试剂
1. PBSPH7.2,9 mmol/L磷酸盐缓冲液含140 mmol/L NaCl。
2. PBS-Tween pH7.2 PBS含0.05%Tween20,简称PBS-T。
3. 底物溶液:100 mL 2 mmol/L ABTS溶液中含100 mmol/L醋酸钠,50 mmol/L磷酸钠,2.5 mmol/L H2O2
4. 沉淀剂:①:100 mL pH8.0,20 mmoL/L Tris-甘氨酸-HCl缓冲液中含20g PEG 4 000,0.8 g Rivanol;沉淀剂②:100 mLpH2.0.100 mmol/L甘氨酸-HCl缓冲液中含20g PEG4000。
三、实验步骤
1. 用盐和/或PEG沉淀血浆中C5:在微量反应板中加入EDTA抗凝血浆100 g/L,然后加人100/uL沉淀剂,用下述三种方法中任何一种沉淀血浆中C5。
(1) 在微量反应板中加入100 uL 2 mol/L HCl与100 uL EDTA抗凝血浆混合,室温5 h。加入HCl后血浆pH值在1.0-1.5之间。上清用4倍体积的0.29 mol/L Tris调节至pH7.1-7.4。
(2)在微量反应板中加入100 uL沉淀剂①,室温30 min。
(3)在微量反应板中加入100 uL沉淀剂②(血浆pH值在4.0-4.5之间)。室温30 min。用方法(2)和方法(3)沉淀C5后,上清加入4倍体积的含0.05% Tween 20 pH7,10.21 mol/L Tris-HCl缓冲液,血浆被稀释10倍。
2. 用抗C5a单克隆抗体(McAb)包被酶标反应板:用pH10.6,50mmol/L碳酸钠溶液将抗C5aMcAb稀释成10 ug/mL,每孔加100 uL,4℃ 16 h。次日取出每孔加含1%(W/V)明胶的PBSl50gL,室温lmin;然后用PBS-Tween 20洗涤一次。
3. 样本中CSa的检测:
洗涤后的酶标板,每孔加入方法1)、2)或3)处理的血浆样本zoot&,4℃16 h,用PBS-Tween20洗涤1次,每孔加入用含0.1%明胶的PBS-T稀释的兔抗人CSa-IgC.多克隆抗体(46 ug/mL)100t&,室温2 h,用PBS-Tween20洗涤3次;每孔加入用含0.1%明胶PBS-T稀释的过氧化物酶标记的猪抗兔IgClOOt&(稀释前lmL过氧化物酶偶联物内加100 ul无关鼠McAb、10 ul人血浆或10 ul激活的人血清处理),室温2 min,每孔用PBS-Tween20洗涤4次;每孔加入底物溶液100 ul,1 min后以PBS-T调零,每3 min于酶标仪405n m处读取OD值。以OD/min增加量计算过氧化物酶活性。其活性与血浆中C5a含量呈正相关。本法最低检测极限为1 ng/mL,此法未检测出正常人新鲜血浆中的C5a。
4. 标准曲线的绘制:取已知浓度纯化的C5a,对倍稀释成一系列不同的浓度(0.039-5.000 ng/mL),分别加入包被有抗C5aMcAb的酶标板中,然后按上述方法依次加入兔抗人C5a-IgC和过氧化物酶偶联的猪抗兔IgC及过氧化物酶的底物,以PBS-Tween调零点,读取OD40s/min增加量,以C5a(desarg)浓度为横坐标,OD40s/minx 200为纵坐标绘制标准曲线。每次绘制标准曲线应取6个已知浓度的纯化C5a。
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