血浆中C5a的ELISA测定
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一、实验原理
将抗C5a单克隆抗体包被固相聚苯乙烯板，加入经聚乙二醇(PEG)处理的待测样本，然后依次加入兔抗人C5a-IgC多克隆抗体和过氧化物酶标记的猪抗兔IsC，再加入底物2，2’-连氮-双(3-乙基苯骈唑啉-6-磺酸盐)(ABTS)和H2O2显色，于酶标仪405 mn处测定每分钟光密度增加量(OD/min)，以OD/min为纵坐标，C5a标准晶浓度为横坐标绘制标准曲线图，求出待测样本中C5a的含量。
二、实验试剂
1. PBSPH7.2，9 mmol/L磷酸盐缓冲液含140 mmol/L NaCl。
2. PBS-Tween pH7.2 PBS含0.05%Tween20，简称PBS-T。
3. 底物溶液：100 mL 2 mmol/L ABTS溶液中含100 mmol/L醋酸钠，50 mmol/L磷酸钠，2.5 mmol/L H2O2。
4. 沉淀剂：①：100 mL pH8.0，20 mmoL/L Tris-甘氨酸-HCl缓冲液中含20g PEG 4 000，0.8 g Rivanol；沉淀剂②：100 mLpH2.0.100 mmol/L甘氨酸-HCl缓冲液中含20g PEG4000。
三、实验步骤
1. 用盐和/或PEG沉淀血浆中C5：在微量反应板中加入EDTA抗凝血浆100 g/L，然后加人100/uL沉淀剂，用下述三种方法中任何一种沉淀血浆中C5。
（1） 在微量反应板中加入100 uL 2 mol/L HCl与100 uL EDTA抗凝血浆混合，室温5 h。加入HCl后血浆pH值在1.0-1.5之间。上清用4倍体积的0.29 mol/L Tris调节至pH7.1-7.4。
（2）在微量反应板中加入100 uL沉淀剂①，室温30 min。
（3）在微量反应板中加入100 uL沉淀剂②(血浆pH值在4.0-4.5之间)。室温30 min。用方法（2）和方法（3）沉淀C5后，上清加入4倍体积的含0.05% Tween 20 pH7，10.21 mol/L Tris-HCl缓冲液，血浆被稀释10倍。
2. 用抗C5a单克隆抗体(McAb)包被酶标反应板：用pH10.6，50mmol/L碳酸钠溶液将抗C5aMcAb稀释成10 ug/mL，每孔加100 uL，4℃ 16 h。次日取出每孔加含1%(W/V)明胶的PBSl50gL，室温lmin；然后用PBS-Tween 20洗涤一次。
3. 样本中CSa的检测：
洗涤后的酶标板，每孔加入方法1)、2)或3)处理的血浆样本zoot&，4℃16 h，用PBS-Tween20洗涤1次，每孔加入用含0.1%明胶的PBS-T稀释的兔抗人CSa-IgC．多克隆抗体(46 ug/mL)100t&，室温2 h，用PBS-Tween20洗涤3次；每孔加入用含0.1%明胶PBS-T稀释的过氧化物酶标记的猪抗兔IgClOOt&(稀释前lmL过氧化物酶偶联物内加100 ul无关鼠McAb、10 ul人血浆或10 ul激活的人血清处理)，室温2 min，每孔用PBS-Tween20洗涤4次；每孔加入底物溶液100 ul，1 min后以PBS-T调零，每3 min于酶标仪405n m处读取OD值。以OD/min增加量计算过氧化物酶活性。其活性与血浆中C5a含量呈正相关。本法最低检测极限为1 ng/mL，此法未检测出正常人新鲜血浆中的C5a。
4. 标准曲线的绘制：取已知浓度纯化的C5a，对倍稀释成一系列不同的浓度(0.039-5.000 ng/mL)，分别加入包被有抗C5aMcAb的酶标板中，然后按上述方法依次加入兔抗人C5a-IgC和过氧化物酶偶联的猪抗兔IgC及过氧化物酶的底物，以PBS-Tween调零点，读取OD40s/min增加量，以C5a(desarg)浓度为横坐标，OD40s/minx 200为纵坐标绘制标准曲线。每次绘制标准曲线应取6个已知浓度的纯化C5a。
