基因的PCR扩增(聚合酶链式反应)
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实验原理
单链DNA在互补寡聚核苷酸片段的引导下,可以利用DNA聚合酶按5’→3’方向复制出互补DNA。这时单链DNA称为模板DNA,寡聚核苷酸片段称为引物(Primer),合成的互补DNA称为产物DNA。双链DNA分子经高温变性后成为两条单链DNA,它们都可作为单链模板DNA,在相应的引物引导下,用DNA聚合酶复制出产物DNA。
PCR反应应用以上的基本过程,分别在待复制的已知序列DNA分子两端各设计一条引物,其中在DNA 5’端的引物(Pl)对应于上链DNA单链的序列,3’端的引物(P2)对应于下链DNA单链的序列,Pl和P2按5’→3’方向相向配置。
在含有引物、DNA合成底物dNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dTTP 四种脱氧核糖核苷酸等摩尔数混合物)的缓冲液中,通过高温变性,使双链DNA变成单链DNA模板,降低温度复性,使引物与模板DNA配对,利用DNA聚合酶便可合成产物DNA。
引物和dNTPs过量,则在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环,使产物DNA重复合成,并且在重复过程中,前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA参与DNA的合成,使产物DNA的量按2n方式扩增,所以这一反应称为聚合酶链式扩增反应。理论上如果引物及dNTP的量能够满足,则这一过程可无限重复,使模板DNA无限扩增。
PCR反应使几个DNA模板分子通过数小时扩增后增加到百万倍以上,因此能用微量样品获取目的基因,同时也完成了基因在体外的克隆,成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。另外在医学研究和医疗诊断中亦体现出极大的应用价值。
PCR反应应用以上的基本过程,分别在待复制的已知序列DNA分子两端各设计一条引物,其中在DNA 5’端的引物(Pl)对应于上链DNA单链的序列,3’端的引物(P2)对应于下链DNA单链的序列,Pl和P2按5’→3’方向相向配置。
在含有引物、DNA合成底物dNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dTTP 四种脱氧核糖核苷酸等摩尔数混合物)的缓冲液中,通过高温变性,使双链DNA变成单链DNA模板,降低温度复性,使引物与模板DNA配对,利用DNA聚合酶便可合成产物DNA。
引物和dNTPs过量,则在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环,使产物DNA重复合成,并且在重复过程中,前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA参与DNA的合成,使产物DNA的量按2n方式扩增,所以这一反应称为聚合酶链式扩增反应。理论上如果引物及dNTP的量能够满足,则这一过程可无限重复,使模板DNA无限扩增。
PCR反应使几个DNA模板分子通过数小时扩增后增加到百万倍以上,因此能用微量样品获取目的基因,同时也完成了基因在体外的克隆,成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。另外在医学研究和医疗诊断中亦体现出极大的应用价值。
常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增,反应循环数为25~35,变性温度为94℃,复性温度为37℃~55℃,合成延伸温度为72℃,DNA聚合酶为Taq酶(可耐受95℃左右的高温而不失活),DNA扩增倍数为106~109。
引物的设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增,通常引物设计要遵守以下几条原则:
①引物长度:15~25个核苷酸。
②CG含量为40%~60%。
③Tm值高于55℃[Tm=4(C+G)+2(A+T)计算]。
④引物与模板非特异性配对位点的碱基配对率小于70%。
⑤两条引物间配对碱基数小于5个。
⑥引物自身配对(特别是在引物的3’端)形成的茎环结构,茎的碱基对数不大于3。
由于影响引物的设计的因素比较多,所以常常利用计算机来辅助设计。
实验材料和试剂
(一)试剂
1. 4×dNTP:
1 mmol/L dATP
1 mmol/L dATP
1 mmol/L dCTP
1 mmol/L dGTP
1 mmol/L dTTP
2. Taq酶:5 U/ml
3. 模板DNA:0.1 mg/ml
4. 引物:Pl: 5'-TTCCATATGCCTACTTCAAGTTCT-3'
P2:5'-ACCTAAGCTTGCTTCAAGTTAGTGT-3'
引物溶液浓度:50 nmoI/L
(二)器皿
0.5 ml薄壁Eppendorf管
(三)仪器
PCR自动扩增仪 离心机
微量注射器 微量移液器
电泳仪 水平电泳槽
透射紫外观察仪
实验步骤
(一)准备PCR反应溶液
1. 取薄壁0.5 ml Eppendorf管一只,用微量注射器按以下顺序分别加入各试剂。
10×缓冲液 10 ml
4×dNTP 10 ml
引物Pl 1 ml
引物P2 1 ml
模板DNA 1 ml
Taq酶 1 ml
加无菌双蒸馏水至 100 ml
2. 用手指轻弹Eppendorf管底部,使溶液混匀。在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底。
3. 加石蜡油50 ml封住溶液表面。
(二) PCR扩增反应
将加好样品的Eppendorf管插在PCR自动扩增仪样品板上,95℃10分钟,使模板充分变性。然后按以下步骤在PCR自动扩增仪中进行反应,25~35个循环。
93℃ 30秒
55℃ 45秒
72℃ 45秒
反应完毕,将样品取出置于冰浴中待用。
(三)结果检测
本实验PCR扩增的产物DNA片段长度为609 bp,适合于1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。