基因工程抗体细胞质表达
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基因工程抗体细胞质表达
胞内表达抗体主要采用高表达方式，其表达结果因抗体片段的不同而有较大差异，主要取决于翻译起始位点的设计、片段对蛋白酶的敏感性和宿主菌。高表达抗体的结果常常是以包涵体(inclusion body)形式存在，除载体方面的原因外，这可能与抗体表面疏水性强有关。包涵体可以防止宿主对抗体的降解，并利于纯化。经过变性、复性及去除蛋白的N端甲酰甲硫氨酸或甲硫氨酸，可以得到重新折叠的有抗原结合活性的天然分子。对于不同的蛋白，复性条件是不同的。
【材料和试剂】
（1）大肠杆菌XL1-Blue。
（2）载体pROH80，携带谷胱甘肽转移酶基因(GST)，能与插入的抗体基因表达出融合蛋白(GST-ScFv)。
（3）抗膀胱癌McAb重链(VH)366bp和轻链(VL)324bp基因，连接肽为(GGGGS)3。
（4）超声仪（Cole Parmer4710)。
（5）IPTG。
(6) 包涵体溶解液：0.2mol/L Tris-HCl pH8.2、0.1mmol/L β-巯基乙醇。
【操作步骤】
(1)将VH、VL基因分别插入载体pROH80的克隆位点，构建成单链抗体ScFv，转化XL1-Blue感受态细胞，筛选的阳性克隆用酶切鉴定。
(2)接种单菌落(含pRS80)于2ml LB培养基(含Amp 0.1mg/ml)，37℃培养过夜。次日，1：100稀释加至LB中，37℃培养3～4h，至OD600 约1.5时，加入0.1～1mol/L IPTG，转至30℃诱导4～6h。
(3)将培养的菌液于4000r/min离心10min，收集菌体，重悬于PBS中，超声破碎细胞(duty circle 30％，output 4，20min)，12 000r/min离心20min，收集沉淀物。
(4)将沉淀物用3mol/L尿素、25mmol/L Tris-HCI pH8.0 10mmol/L EDTA溶液洗涤5次，每次12 000r/min离心20min，收集沉淀。
(5)用包涵体溶解液(0.2mol/L Tris-HCl pH8.2、0.1mmol/L β-巯基乙醇)悬浮沉淀，定温3～5h，待溶液清澈透明，1000r/min离心20min，收集上清。
(6)将变性的包涵体蛋白用6mol/L尿素、2.5mmol/L Tris-HCl pH8.0，lmmol/L EDTA，5mmol/L DTT溶液透析，4℃。
(7)透析过的包涵体溶液经DE-52离子交换柱洗脱，紫外检测收集蛋白峰，经15％SDS-PAGE电泳检测纯度。
(8)对收集的蛋白溶液，用3mol/L尿素、25mmol/L Tris-HCl pH8.0、1mmol/L氧化型谷胱甘肽、0.1mmol/L还原型谷胱甘肽溶液稀释至蛋白浓度为0.1mg/ml，室温复性24～48h。
