丁香实验_LOGO
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册
丁香通
点赞
收藏
wx-share
分享

基因工程抗体的表达

互联网

874
基因工程抗体的表达
 
    基因工程抗体的表达主要问题是选择适当的宿主和表达载体的设计,这是获得高亲和力抗体的重要前提。目前,广泛用于研究抗体表达的宿主系统是大肠杆菌和哺乳动物细胞,最近在植物中表达抗体成为抗体研究的热点。表达抗体的纯化手段当前发展为金属螯合层析(IMAC),其特点为快速简便,效率及纯度都很高。抗体的活性测定除采用常规方法外,可用间接方法如免疫竞争抑制等,可测定因缺少恒定区的小分子抗体如ScFv、VH的抗原结合活性。另外,由于高纯度的抗原难以大量获得,也给抗体的鉴定带来许多困难。抗体的表达首先要选择适合的表达载体或重新构建载体;其次,依赖于不同的宿主系统对抗体基因进行表达及表达产物的加工和修饰,使其具有抗原结合活性。目前,多种宿主系统中表达抗体均取得成功。
 
    1.哺乳动物细胞的表达  哺乳动物细胞具有高效表达内源性重、轻链基因并将抗体糖基化、正确折叠和装配以及分泌活性抗体的能力,便于对抗体亲和力、特异性等的鉴定。通常使用的表达载体,有一个真核转录单位,一个启动子,剪接信号和PolyA添加信号及筛选标志,所用的表达元件来自病毒或抗体基因自身,如启动子、增强子。由于抗体表达的组织特异性,如果抗体基因要在骨髓瘤细胞中表达,必需使用抗体基因本身的调控元件。早期使用的骨髓瘤细胞如J558,及后来采用的非骨髓细胞表达体系如CHO细胞(中华地鼠卵巢细胞),均为低拷贝表达,此时将重、轻链基因共转染受体细胞,利用双重选择标志筛选如gpt和neo,其转染效率及表达产量均很低。为了解决以上问题,发展构建了扩增载体,用于扩增标志基因,这一基因编码细胞生存所必需的酶蛋白,此酶可被抑制剂有效抑制,通过逐渐增加抑制剂量,筛选到高拷贝扩增基因的高效表达,如扩增标志基因谷氨酰胺合成酶GS,可被MSX(L-methionine sulphosimine)所抑制,GS显性选择标志可在多种类型细胞中表达,通过大剂量一次性筛选,可获得高拷贝扩增。扩增标志基因可分别位于重、轻链载体上,通过共转染来获得抗体,也可将重、轻链串联于一个表达载体上,此时基因顺序很重要,因为下游启动子可被上游启动子通读而产生闭合现象。
 
    2.大肠杆菌中表达  大肠杆菌虽没有糖基化修饰的功能,但是,现在已经证实表达的抗体片段如Fab、ScFv、VH能正确折叠及装配成具有抗原特异性结合活性的天然抗体。必须注意:只有同时分泌两条链或分泌单链才能使表达的抗体片段成为功能性分子。目前,用于构建载体的调控元件有:启动子如PLPR、LacZ、Tac、T7等;操纵子如SD序列、核糖体结合位点、启始密码子AUG;转录和翻译终止子;抗性标志及抗体基因插入位点。如果是单链抗体,必需设计适宜连接肽。
提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序