基因工程抗体分泌型表达
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基因工程抗体分泌型表达
在表达载体上装入信号肽序列，可以使抗体片段分泌到细胞外或周质腔。在表达时抗体完成切断信号肽，蛋白质折叠，二硫键形成，重、轻链的正确装配等一系列过程，能形成有活性的抗体分子。信号肽可利用已知的PelB以及碱性磷酸酶(PhoA)；外膜蛋白A(OmpA)；A-溶血素蛋白(HlyA)等，将抗体基因两条链分别融合到一种或两种信号肽后面，或者同时融合到同一种信号肽后面。融合点被断裂后必需能产生正确的Ｎ端。分泌到周质腔的抗体能正确地折叠和二硫键的形成，另外由于周质腔的蛋白酶较少，减少了对抗体的降解。为提高表达量可以选择蛋白酶缺陷宿主菌(LonHrpi)，降低诱导温度，调整培养基状态等条件。
【材料和试剂】
(1) 载体pWAI80。
(2) 抗体VH、VL基因。
(3) 大肠杆菌JM83。
(4) IPTG。
(5) SB培养基。
【操作步骤】
(1)将VH、VL基因插入载体pWAI80，构建成ScFv抗体，此载体称pFS80。
(2)接种单菌落（pWAI80)于10ml SB培养基中(含Amp 0.1mg/ml；20mmol/L MgCl2 )，37℃培养至OD600 达到0.2左右，加1mmol/L IPTG，30℃诱导表达8～12h。
(3)4000r/min离心10min，收集菌体和培养基上清，将菌体悬浮于0.1体积的PBS中，经过液氮冻结5min，37℃融化，反复冻融4次，12000r/min离心10min，收集上清。同时与培养基上清一起测定活性，或纯化后鉴定。可以加蛋白酶抑制剂(PMSF)0.1mg/ml保存。
