从免疫亲和层析柱上洗脱抗原方法

互联网2010-12-02

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【准备工作】

此步骤最大的难点是确定恰当的洗脱条件。为了获得一个清晰的洗脱峰和较纯的抗原，需要花费大量的时间进行试验和调整洗脱条件。

【溶液和特别设备】

（1）预洗脱缓冲液

（2）洗脱缓冲液

（3）中和缓冲液

（4）简单的层析装置

（5）透析袋及相应的装置

如果是对蛋白层析很有经验者可采用分段增加洗脱条件而不采用逐步洗脱。

【操作步骤】

（1）用20倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱，以更换柱内的缓冲液。

（2）采用分段洗脱，连续以 0.5倍柱床体积的洗脱缓冲液流经层析柱，用试管收集各组分，如果洗脱液pH偏高或偏低，收集管中需加入0.1柱床体积的中和缓冲液。

（3）测试每管抗原量，将含量高的各管合并，根据抗原的用途，可将获得的蛋白洗脱液透析去盐或用缓冲液调节pH值。

（4）再用20倍柱床体积的起始缓冲液通过柱基质，使层析柱再生。加入0.01％硫柳汞，可以长期贮存(4 ℃)。

【测试洗脱条件的策略】

建立最佳洗脱条件需要积累经验，将可能利用的洗脱缓冲液先在小型柱上进行预试，以确定最适条件。最好的方法是尽可能试验多种抗体和不同的洗脱条件，以摸索出最佳组合。

理想的洗脱峰形为一个清晰而陡峭的峰，用单一缓冲液处理后即可使抗原完全释放。在选择一个合适的起点时需要综合考虑以下三点：

①纯化抗原的用途，对于一般蛋白质化学技术，抗原无需保持原来活性；如果是进行酶的功能研究，洗脱条件则应尽可能温和；

②如果抗体层析柱需要再次利用，应采用温和的洗脱条件。

③保证最后的预洗脱缓冲液应与洗脱缓冲液不矛盾。例如预洗脱缓冲液的缓冲能力应足够低，可使紧接着使用的缓冲液pH值迅速发生改变。

如果为了测试最温和的洗脱条件，开始首先用酸性条件，然后用碱性洗脱缓冲液对照，如果这些条件不能洗脱抗原，再试用其它条件。一般选用各种条件的次序是：酸性（pH3~1.5）；碱性（pH10~12.5）；MgCl₂ （3~5 mol/L）；LiCl（5~10 mol/L）；水；乙二醇（25~50%）；二氧六环（5~20%）；硫氰酸盐（1~5 mol/L）；胍（2~5 mol/L）；尿素（2~8 mol/L）；SDS（0.5~2％）。

在标准的洗脱条件下很难洗脱的抗原一般是由多种化学键连接的。将几种洗脱条件结合使用可以有效克服这些问题。

如果抗原不能用简单的条件洗脱，更换抗体可能比试用各种条件要容易些。

一般使用过的层析柱比新柱洗脱更容易，所以新柱洗脱一般需要较苛刻的条件才能洗脱抗原。

试用梯度洗脱方法，使抗原的洗脱峰清晰而陡峭。

避免使用二硫苏糖醇和其他还原剂，因其能破坏抗体重链和轻链间的链间二硫键。

值得注意的是当测试不同的洗脱条件时，有些缓冲液虽然不能洗脱抗原，但在其他条件改变后仍可能是有效的洗脱缓冲液。

实际上有些非洗脱缓冲液，可能改变抗原抗体反应的平衡。例如高盐条件具有疏水作用。应用这些条件可以比较容易地收集抗体基质上的抗原。