利用HLA/抗原肽四聚体和流式细胞分选仪制备CTL细胞克隆
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利用HLA/抗原肽四聚体和流式细胞分选仪制备CTL细胞克隆
免疫反应的最显著特点是其特异性，是由于免疫分子与相应的抗原表位结合具有高度特异性。利用免疫反应的特异性，能够分离出抗原特异性的淋巴细胞克隆。B细胞上BCR（或抗体）能够直接识别抗原表位，利用某种抗原表位就可以鉴定和分离相应的B细胞克隆（或抗体），过程相对简单。与B细胞不同，T细胞上TCR识别的配体是抗原肽/MHC分子复合物，而不是天然的抗原表位，因此分离T细胞克隆的过程相对复杂。
随着对T细胞识别机制的不断深入和分子生物学技术的不断发展，目前已经能够在体外人工合成TCR结合的配体―HLA抗原肽四聚体（HLA-peptide tetramer）。利用HLA-抗原肽四聚体和流式细胞分选仪能够从淋巴细胞中分离出抗原特异性的T细胞克隆，结合T 细胞培养，能够扩增相应的T细胞克隆。该分离特异性T细胞克隆的方法与传统的细胞培养-有限稀释法比较，具有操作简单，克隆效率高等优点。不足之处是需要制备HLA-抗原肽四聚体，并且需要流式细胞分选仪。
【材料和试剂】
（1）外周血淋巴细胞，健康人外周血10-20ml，肝素抗凝，注意供者的HLA型别，可根据研究目的选择HLA-A2阳性或HLA-A2阴性个体的外周血。
（2）T2细胞株，为TAP缺陷的细胞株，HLA-I类型别为HLA-undefined0201，-undefined05，-Cw1。因其TAP缺陷，其表达HLA-I类分子的抗原肽结合槽未结合抗原肽，能够与加入的外源性抗原肽结合，形成HLA-I-抗原肽复合物，能够被相应的T细胞克隆所识别。
（3）抗原肽，8-10氨基酸残基长度的短肽，通常采用人工合成的方法制备。其氨基酸的组成与顺序是由研究目的（即T细胞克隆的特异性）决定
抗原肽致敏T2细胞：用无血清培养液调T2细胞浓度至1X106 个细胞/ml，取上述浓度T2细胞悬液1ml，加入10uM抗原肽，混匀后置室温作用4小时后，用RPMI1640洗涤。
（4）HLA-抗原肽四聚体，制备和使用详见本章第二节。
（5）伺养细胞，取供者自身PBL，经30Gy射线灭活。
含10%AB血型人血清的RPMI1640培养基
（6）IL-2以及细胞培养所需的试剂和设备
（7）流式细胞分选仪
【操作步骤】
（1）取抗凝外周血10-20ml，用Ficoll-Hypaque密度剃度离心法分离出淋巴细胞，用RPMI洗涤2次。
（2）取1X106 个经抗原肽致敏的T2细胞，用200Gy射线灭活，与步骤（1）分离的淋巴细胞混合，培养液为含10%AB血型人血清的RPMI1640培养基，置37℃，5％CO2 培养5天。
（3）培养5天后，半量更换培养液，并加入IL-2，终浓度为20U/ml。
（4）培养10天后，取1X106 个经抗原肽致敏并经射线灭活的T2细胞，用上述含IL-2的培养液重悬，继续培养5天，并注意观察细胞的生长和增殖情况。
（5）当细胞明显增殖时，可以用流式细胞分选仪和HLA-抗原肽四聚体进行特异性T细胞克隆分选，分选出HLA-抗原肽四聚体特异性的T细胞，用上述含IL-2的培养液重悬，并以1个细胞/孔的浓度加入96孔培养板中。培养板中每孔含2X104 个抗原肽致敏并经射线灭活的T2细胞作为刺激细胞，以及4X104 个经射线（30Gy）灭活的自身PBL作为伺养细胞。
（6）按照上述的培养条件继续培养，每周半量更换培养液，换液时加入用上述含IL-2培养液重悬的抗原肽致敏并经射线灭活的T2细胞（2X104 /孔）。
（7）如果培养孔中的T细胞（即CTL）能够特异性识别HLA-抗原肽复合物（例如T2细胞的HLA-A2与加入的抗原肽形成的HLA-抗原肽复合物），该孔的CTL克隆将会发生扩增。
（8）用抗原肽致敏的T2细胞（或者根据研究目的，采用表达相同HLA-I分子以及相同抗原肽的其他细胞）作为靶细胞，用标准的细胞毒实验（例如51 Cr释放试验）对扩增的CTL克隆进行功能鉴定。
（9）对于功能良好的CTL克隆，可以用于T细胞的功能研究或置液氮中保存。
【注意事项】
（1）在静止T细胞中，抗原特异性T细胞的数量极低，约占静止T细胞数量的10-4 ~10-6 。在抗原致敏的个体中，抗原特异性T细胞的数量将会增高。因此，在抗原致敏个体的外周血中克隆相应抗原特异性T细胞效率较高。
（2）TCR识别的配体是HLA-抗原肽复合物，在用HLA-抗原肽四聚体分离特异性T细胞克隆时，特别注意HLA型别，要求HLA-抗原肽四聚体与刺激细胞（抗原提呈细胞）的HLA型别相同。
（3）在使用细胞分选仪分选T细胞之前，IL-2的量不宜过高，以免发生非特异性增殖。
（4）上述实验方法利用T2细胞作为抗原提呈细胞，根据研究目的也可以选用其他细胞作为抗原提呈细胞，此时应注意根据该细胞的HLA型别和所提呈的抗原肽设计和制备HLA-抗原肽四聚体。
