利用显微注射技术制备转基因兔

器材：

①注射器

②无菌手术器械

③细胞培养皿

④移卵针

⑤38 ℃、5％CO₂ 培养箱

⑥倒置显微镜、显微操作仪

⑦PCR 仪

试剂：

①材料：兔

②孕马血清促性腺激素、人绒膜促性腺激素

③M2 培养液、M16 培养液

④透明质酸酶

⑤戊巴比妥钠溶液

利用显微注射技术制备转基因兔的基本过程可分为如下几步：

1.超数排卵

（1）在实验开始的第 1 天，供体兔肌内注射 PMSG（150 U），FSH 在实验开始的前天每 12 小时皮下注射一次，剂量 0.5 AU，共 6 次。

（2）第 4 天，供体兔分别与两只雄兔交配，以保证能够受精。

（3）交配以后，静脉给予人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）100 U，诱导排卵。

2．胚胎采集

（1）用合适的缓冲液或培养液，例如 10％FBS-PB1 或 M2 培养液，冲洗输卵管，获得受精卵。一般可收集交配（注射 hCG）17～19 小时后家兔的受精卵用于显微注射。

（2）用合适的麻醉剂过量麻醉处死供体家兔，分离其输卵管和部分卵巢。在输卵管壶腹部，可以看到有卵细胞存在。用 10 mL 注射器连接 18 号针头，从卵巢一侧插入，用 5～10 mL 液体冲洗输卵管，在输卵管另一侧将含有受精卵的液体收集于试管或平皿中备用。

3．原核显微注射

（1）利用显微操作仪，在显微镜下将外源 DNA 溶液注射到原核里。

（2）显微注射针刺进雄性原核后保持位置不变，向雄性原核注射 DNA 溶液，如注射成功，可见雄性原核稍微膨胀。用于显微注射的 DNA 溶液的纯度和浓度非常重要，如果 DNA 纯度不好，含有的杂质很容易堵塞注射针尖；如果 DNA 浓度过高，会影响胚胎的发育。

4．胚胎移植

（1）胚胎移前，代孕家兔应采用合适的药物麻醉。

（2）代孕雌兔在供体雌兔注射 hCG 的同时给予 50 UhCG。受精卵显微注射后可在 CO₂ 培养箱内培养 2～3 小时（5％CO₂,38.5 ℃）。给每只代孕家兔移植 20～30 枚 CO₂ 培养后存活的受精卵。CO₂ 培养箱内培养 2～3 小时，受精卵的存活率为 80％～90％，熟练的技术是受精卵高存活率的保证。

5．转基因的鉴定

（1）通常剪取 4 周龄家兔少许耳组织或采取血样，提取基因组 DNA，用 PCR 或 Southern blotting 法筛选转基因家兔。

（2）如果转基因翻译出来的蛋白质可分泌至血液或乳汁中，可直接采用 Western blotting 或 ELISA 检测。一般转基因效率为 1.5％～16.7％（平均约 6％）。