利用显微注射技术制备转基因小鼠

器材：

①注射器

②无菌手术器械

③细胞培养皿

④移卵针

⑤37 ℃、5％CO₂ 培养箱

⑥倒置显微镜

⑦PCR 仪

试剂：

①材料：C57BL／6J 小鼠

②孕马血清促性腺激素、人绒膜促性腺激素

③M2 培养液、M16 培养液

④透明质酸酶

⑤戊巴比妥钠溶液

利用显微注射技术制备转基因小鼠的基本过程可分为如下几步：

（一）供体小鼠的超数排卵

1．小鼠品系的选择 一般普遍采用（C57BL／6JxCBA）的杂交一代或 FVB 或 C57BL／6J。

2．小鼠周龄及体重 周龄：4～6 周龄；体重：12.5～14 g。

3．超排用激素及使用剂量 孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG），人绒膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，HCG），每只小鼠各 5～10 U。

4．注射方式及日程 腹腔注射；第一天：3：00 pm 腹腔注射 PMSG（光周期：5：00 am～7：00 pm）；第三天：1：00 pm 腹腔注射 HCG（光周期：5：00 am～7：00 pm）。

5．交配

（1）受精卵供鼠：注射完 HCG 后的雌鼠立即放入装有雄鼠的笼中进行交配，次日晨检阴栓。

（2）假孕母鼠：取 6 周龄以上（体重＞20 g）的母鼠（毛色最好和供体母鼠毛色有明显区别）与相同品系结扎公鼠合笼交配，时间与受精卵供鼠一致。

6．检栓

（1）时间：第 4 天清晨。

（2）方法：观察合笼的母鼠的阴道口是否有白色的阴栓，发现有阴栓的受精卵供鼠和假孕母鼠带出动物房供实验使用。

（二）用于原核注射的受精卵的采集

（1）将供体小鼠放置于笼架上，让它抓住笼架铁丝，然后一只手按住其后脑与颈部衔接的地方，另一只手将其尾巴往后拉至感觉其颈部已被拉断为止。

（2）将处死的小鼠腹部朝下平放于一操作台上，并喷洒消毒液在其背部和尾部根部，这样可以减少其毛发对取出组织的污染。

（3）夹住其背部的毛皮并在其接近尾巴的背部横向剪一小口，然后将其皮毛拉开把背部完全暴露出来。用剪刀在其腰部靠近脊椎的体壁上剪一小口（左右两边都要剪），通过这个开口可观察到输卵管，卵巢和子宫。

（4）用镊子夹住脂肪垫，轻轻地连同卵巢、输卵管和子宫拉出体壁。生殖管和体壁之间有一层透明的带有微细血管的薄膜，在这个薄膜上用剪刀扎一个孔，将其与子宫、输卵管和卵巢剥离开。拉住子宫，将输卵管剪下。

（5）在一个 90 mm 的细胞培养皿上做 4～5 个 M2 培养液的液滴，每个 50 μl，再做一个 200 μl 的大液滴和 150 μl 相对小的液滴。将剪下的输卵管放入 150 μl M2 液滴中，可以将多只供体的输卵管同时放入此液滴。

（6）此时，受精卵被卵丘团细胞包围并聚集在输卵管靠近卵巢的壶腹部位置，此段输卵管会被撑得很大，可以明显地看出。

（7）在收集受精卵前，把所有剪下的输卵管放入 150 μl 的 M2 液滴中。然后将一段输卵管放入 200 μl M2 液滴中，用眼科镊夹破输卵管膨大部，将包围着受精卵的卵丘团细胞释放出来，然后将输卵管去除，重复此步骤将所有输卵管的卵丘团细胞都释放在此液滴。一个这样的液滴可以收集多达 10 只供体小鼠的受精卵。

（8）添加 10 μl 500U／mL 透明质酸酶入包含有卵丘团细胞的 200 μlM2 培养液，用枪头轻轻混合，然后放置 5 分钟再混合一下。消化完全后，用移卵针将受精卵吸出转移到 50 μl 的新鲜 M2 溶液中（图 5-1-8c）。将受精卵在多个新鲜液滴中清洗掉透明质酸酶，然后将其转移到覆盖了矿物油的、预先在 37 ℃，5％CO₂ 培养箱中平衡过夜的 M16 培养液中。M16 液滴放于 30 mm 有盖培养皿中，在 37 ℃、5％CO₂ 培养箱中培养至显微注射。

（三）小鼠受精卵原核显微注射

（1）显微注射系统介绍：任何基本的显微注射工作站都包括位于中间的倒置显微镜和位于两侧的显微操作臂。两侧的显微操作臂允许操作者在显微注射中能够轻松地执行非常细微而又精确的操作。另外，气控注射针和持卵针内的压力都必须是能够调节的。

（2）用 M2 培养液在有盖培养皿的盖子中间做一个椭圆形的液滴，并且用矿物油覆盖（图 5-1-11）。

（3）将持卵针固定在左边的显微操作臂上，然后用加样枪头把 DNA 样品加入注射针中并把注射针安装在右边的显微操作臂上，按气压注射器的「Stand by」键激活注射。把待注射的受精卵移入操作液滴的 a 区。一般情况是在下午 3 点左右开始显微注射。

（4）将显微注射操作液滴放置在倒置显微镜下，伸入持卵针和注射针，并调整它们的位置与培养皿盖底部平行。在低倍（4x）下观察整个液滴，并定位受精卵的位置，确保持卵针与注射针的平行。

（5）在高倍下观察受精卵，确保其两个原核都可见以及它的形态正常，去除所有形态不正常的受精卵。移动注射针靠近一个受精卵的水平中间并调整它们在同一水平面上（注意不要接触到）。如果注射针尖是打开的话，DNA 溶液液流会将受精卵冲开，如果是关闭或者阻塞的话使用高压将注射针尖冲开，并再次检查。如果还是阻塞的话，小心地将注射针在持卵针上磕一下，重复直至针尖被打开。如果注射针尖的直径被磕得很大或者确实不能让注射针畅通，则只能更换注射针。

（6）把持卵针靠近一个受精卵，向左旋转把柄小心地将受精卵吸到持卵针上，直到其被牢牢固定住为止。受精卵的透明带可以观察到被轻微地吸入进持卵针内，但受精卵本身不要被吸得变形。两个原核均可用于注射。

（7）移动注射针到受精卵原核正中平面的同一水平面上，定位在受精卵 3 点钟方向并调整注射针的高度以使注射针尖能很好地聚焦。

（8）将注射针通过透明带插入细胞质并到达原核内。确保原核和注射针始终都处于同一水平面并被聚焦。不要接触到核仁，因为它们很容易粘在注射针上。确定注射针完全到达原核而没有触碰到核仁后，通过气压注射器加压注射 DNA 进入原核。如果原核明显膨大，则说明注射成功，快速抽出注射针。如果原核没有膨大，那么注射针有可能阻塞或者它并没有刺穿透明带，因此试着退回注射针再次刺入，多试几次就会将其刺破。通常在插入注射针时，快速、准确地插入原核可以有效刺破透明带。

（9）显微注射完成的明显标志是原核明显地扩大。当所有的受精卵被注射完成后，应迅速将其移入 M16 或 M2 培养基并放置于 37 ℃ 孵箱培养直至输卵管移植。正常情况下，80％ 以上的受精卵在显微注射后能存活下来。

（四）小鼠胚胎的移植

（1）移植之前，先将戊巴比妥钠溶液（10 mg／mL）按 0.8 mg／10 g 的剂量通过腹腔注射入假孕母鼠体内，使小鼠麻醉。

（2）将小鼠背部朝上放置在解剖台上，剪去鼠体腰部毛发，用 70％ 乙醇消毒后，在小鼠脊柱左侧 1 cm 约与最后一根肋骨平齐的地方用解剖剪剪开一个小口，然后用镊子撕开皮肤肌肉，露出带有脂肪垫的输卵管和卵巢。

（3）在体视显微镜下，找到紧邻卵巢的输卵管腹壶开口，此开口是母鼠卵子从卵巢到达输卵管的必经之路，深埋于卷曲的输卵管内部，并处于卵巢膜包裹之中。

（4）移植结束后，快速缝合伤口，并将小鼠放在干燥、柔软、温度较高的地方进行苏醒，按常规饲养即可，等待到第 20 天左右（19～21 天），植入的受精卵将发育成小鼠出生。

（五）转基因小鼠的鉴定

（1）利用 PCR 扩增测在小鼠基因组中是否存在转入基因。

（2）将得到的 PCR 阳性小鼠挑选出来，提取基因组，并按照转入基因的实际情况设计探针，再运用 southern blot（放射性标记、地高辛标记、生物素标记）检测这些阳性小鼠的基因组中是否存在转入基因。放射性磷 32 标的 southern blot 的灵敏度高于地高辛标记，而生物素标记的灵敏度是最低的，但是由于放射性操作对人体的伤害，目前运用较多的是地高辛标记的 southern blot。