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实验:细胞显微注射技术

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[实验目的]
1 了解细胞显微注射的基本原理
2 掌握细胞显微注射基本技术

[实验原理]
显微注射技术是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核中,使外源基因整合到受体细胞的基因组内,再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的子宫内发育,从而获得转基因动物。它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法,可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移;外源基因的长度不受限制, 可达100kb ;实验周期相对比较短。它的不足之处是:需要昂贵精密的设备;显微注射操作复杂,需专门技术人员;导入外源基因整合位点和拷贝数无法控制;常导致插入位点附近宿主DNA 片段缺失、重组等突变,可造成动物严重的生理缺陷。尽管如此,由于显微注射技术直接对基因进行操作,整合率较高,因而仍是目前建立转基因动物极为重要的方法。
显微注射技术在植物、动物的细胞发育研究的应用,为研究体内生理和体外的生化过程架起桥梁,将特定的分子探针及衍生的细胞间质成分导入活体细胞,为研究控制细胞功能的调控机制提供了新的视野。

[ 仪器 、材料和试剂]
(一) 仪器 和用具:
倒置显微镜(如Nikon TMS 和Diaphot 300/2;Zeiss Axiovert 100或135,或Axioskop FS);
Leitz重型基座(用于安放显微镜和微操作仪);
微操作仪:Leitz(手动系统,安在平台上)或Eppendorf 5171(自动轴向微注射系统,可固定在显微镜的载物台上);
微注射器:Eppendorf 5242,也可选用螺旋推柄的玻璃注射器。
拉针仪:水平拉针仪P87型(如Sutter Instrument Co.(Novato,USA)),或垂直拉针仪720型(如David Kopf Instruments(Tujunga,California,USA)。
玻璃注射针头:可购买厂商拉制好的商品,也可用拉针仪自行拉制(可参照[方法与步骤]中的1.1注射针头的拉制)。
细胞培养设备:细胞培养箱、超净工作台、塑料平皿和盖玻片等。
(二) 材料:
(三) 试剂 :
缓冲培养基(含25mmol/L HEPES pH7.2);注射缓冲液(10mmol/L H2PO4-和HPO42-,pH7.2,84mmol/L K+,17mmol/L Na+,1mmol/L EDTA)

[方法与步骤]
1. 材料准备
1.1 注射针头的拉制
水平拉针仪:装上一根毛细管,拧紧左右两侧的夹子,做好固定,并使其中间部位对准加热丝。设定好电流、拉力和时间。然后按开始键,等待毛细管被拉成两个所需的微注射针头。
垂直拉针仪:把玻璃毛细管固定在上面的夹子上,使其对准加热丝后旋紧。抬起下面的滑夹,固定在毛细管上。调整热度和螺线管范围。
使用拉针仪自行拉制的微注射针头,最好使用硼硅酸盐玻璃的毛细管。可以采用硅烷对注射针头进行处理,以防样品和培养基成分与玻璃的亲水表面相互作用,从而引起针尖阻塞而影响注射。

 

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