膜片钳技术实验

一、玻璃电极的制作

1.拉制电极

程控拉制器的发明大大简化了玻璃电极制作程序。人们只需选用相应的拉制方案，放好玻璃毛细管，就会拉成两个相同的玻璃电极。然而，编制不同的拉制方案是相当困难的，因为不同的参数会影响玻璃电极尖端的形状和开口直径。编写拉制方案的程序通常可以在设备的说明书中找到。

我们需意识到玻璃电极的形状是决定电极电阻的主要因素。现代微处理器控制的设备能分几步拉制玻璃电极。第一步使毛细玻璃管 7~1 〇_—段变细，接下来的几步将之拉制成电极，并决定尖端开口直径。标准膜片电极常分 2?6 步拉制而成。一般来说，增加拉制步数可增加尖端圆锥的角度，因而在尖端开口直径相同的情况下可获得更小的电极电阻。程控拉制器可存储多种拉制方案』其另一个优点是拉制膜片电极的可重复性商。

注意：全细胞记录用的玻璃电极阻抗通常是 1~5MΩ而研究单通道的电极是 5~30MΩ

2.涂 Sylgard

为了减少记录电极的电容，可用绝缘物覆盖其尖端开口附近的表面。这不但可减少背景噪声还可减少掩盖记录信号的电容电流。在细胞贴附式、内面向外式、外面向外式等单通道记录时，这种涂层更加重要；全细胞实验时不是必需的，因为此时电流较大，并且细胞膜电容比膜片电极的电容大得多。一般来说，涂层操作对获得千兆封接非常重要。

Sylgard 是两种成分混合物，广泛地用来制作玻璃电极涂层。先将树脂和催化剂混合到一起后在室温下预固化 2~3 h。充灌在注射器中的预固化 Sylgard 可在冰箱 (_18 亡）中贮存几个月。在显微镜（X10—20) 观察下，通过旋转玻璃电极，用一细针将 Sylgard 涂到其尖端表面（图 6-3A)。尽管涂层要尽可能地接近电极尖端，但要小心避免覆盖尖端的开口，由于只有干净的玻璃才能与细胞膜形成封接，因此在靠近尖端 10~50fxm 范围内不要涂 Sylgard。多数情况下涂层的长度是 5~7 mm。涂上的 Sylgard 需尽快固化，这可通过将玻璃电极尖端置于热气流之中 [图 6-3A(b)] 或放入加热线圈中获得。

注意：如果使用有涂层的玻璃电极未能获取千兆封接，需试一下无涂层的玻璃电极。如果涂层是封接失败的原因，试着延长预固化的时间来增加 Sylgard 的涂层厚度和/或增加玻璃电极尖端非涂区的长度。

此时，玻璃电极不能形成稳定封接是由于①它们有尖锐而不平整的尖端开口边缘和②尽管在涂的过程中非常小心，未固化的 Sylgard 扩散到了玻璃电极尖端开口，并形成了一薄膜而将其覆盖。火抛光可使开口边缘变得平滑，并可去除 Sylgard 薄膜。

3.抛光尖端

在可视控制下用抛光仪（图 6-3B) 来抛光玻璃电极。将玻璃电极尖端置于距被加热到产生暗红色的铂金丝 10~20um 处，抛光过程只需持续数秒，可以观察到玻璃电极尖端玻璃壁变厚，边缘变平滑。

注意：抛光决定了玻璃电极尖端开口最终的直径大小。强抛光可大大减小尖端开口的直径。抛光常在玻璃电极涂过之后、记录开始之前进行。抛光后的电极应避免灰尘。

4.充灌电极

内含玻璃毛细管的电极可用带有合适直径针管的注射器从尾部充灌，而无内置玻璃毛细管的电极需用两步法充灌，第一步是充灌玻璃电极尖端。将尖端浸入含有电极液的小烧杯中，之后在电极尾部通过硅胶管连接的 IOml 注射器施加负压以使电极液吸入电极头端。根据尖端开口直径的不问，尖端充灌需时数秒至 I~2 min。抽吸必须在玻璃电极尖端离开液面之前释放。第二步是使用注射器进行标准的尾部充灌过程。充灌后留在玻璃电极尖端的气泡可以通过轻轻弹击玻璃电极杆部而排出。玻璃电极充灌液体的长度不要超过 5?10 mm。充灌太多液体会增加玻璃电极的电容和电子噪声。

注意：根据膜片钳实验的类型来确定充灌玻璃电极的液体。细胞贴附式和内面向外式记录用外液充灌，而全细胞式和外面向外式记录需充灌内液。从尾部充灌玻璃电极和把电极液加入到烧杯中时，需在针与注射器之间插入过滤器（0.2 Mm)。如果玻璃电极尖端是在烧杯中充灌，当玻璃电极尖端穿过气-液界面和液-气界面时需略施正压，因为这有助于避免液体表面灰尘污染玻璃电极尖端。含 EGTA 的液体能与充灌玻璃电极用的注射器的金属针头发生化学反应，因此，在这种情况下，需用拉细的塑料管替换金属针头。另一种可行的方法是在电极充灌之前从注射器中推出适量的液体。

二、膜片钳实验

5.将充灌好的玻璃电极安装于电极夹持器上，并用螺帽固定。需要注意的是用来固定玻璃电极的橡皮环必须调节至紧密相合。如果不是这样，系统内部将漏气，影响封接的形成。加于系统内部的气压是通过与夹持器上特殊出口相连的硅胶管，或者用嘴或者用 U 形水压力计给予的。为了防止玻璃电极尖端污染，系统中要施加正压，以便当玻璃电极尖端经过气-液界面以及向细胞移动时有液体流出玻璃电极尖端。

玻璃电极进入浴槽液之后，但在接触细胞膜之前，要完成两项操作：测量玻璃电极电阻和补偿偏移电位。将放大器设在电压钳模式，钳制电压（Vh) 设置于〇 mV。施加 50ms 矩形去极化指令脉冲（l~2mV,IHz) 于 Vc(图 6-4A)，以观察漏电流变化（图 6-4B) 〇因为玻璃电极内液表现为线性电阻，因此电流反应也呈矩形（电极电容弓 I 起的瞬时电流可以忽略)，其幅度为 ΔI。

6.电极电阻（RP) 可由（Vc-Vh) 除以ΔI 计算获得。图 64B 的实验中显示RP 值约为 5MΩ。

7.记录电极与浴槽电极之间的偏移电位可通过调节放大器的偏移补偿电路使之为 0。这一步很重要，因为未补偿的偏移电位会叠加到 Vh 上。

8.千兆封接形成。当玻璃电极接触到细胞膜时（通常可看到 AI 幅度的降低)，释放正压，轻轻地施加负压（抽吸)。当玻璃电极尖端与膜形成封接时，接触电阻升高，导致ΔI 显著下降（图 6-4B，千兆封接)。虽然有时千兆封接会自发形成，但大多数情况下抽吸对于封接形成是必要的。千兆封接的电阻通常在 1-100 GΩ之间。千兆封接形成可能需要 Is 至 l~2 min, 并常伴随着背景噪声的减小。

注意：膜片电极只能使用 1 次。如果未能与细胞膜形成千兆高阻封接，应使用另一根玻璃电极，并须重复步骤 1? 步骤 8。如果封接未成功，可以尝试：①检查玻璃电极夹持器是否漏气；②使用无涂层的电极；③配新溶液；④换新标本；⑤改变覆盖火抛光铂金丝的玻璃。

步骤 1~步骤 8 对于所有膜片钳记录模式都是相同的。接下来的 5 步（步骤 9~步骤 13) 将介绍膜片钳技术不同记录模式的获得

三、细胞贴附式

9.第 8 步结束时，细胞贴附式已基本形成（图 6-4B, 细胞贴附式)。另外，还需调节膜片钳放大器相应的电路以补偿快速电容电流，并将增益调至单通道记录所需的值。

注意：对于细胞贴附式记录来说，将 Vh 置于 OmV 是一个合理的选择。假设膜静息电位 Vr=-80mV, 此时，膜片电压降是 Vr-VrH=-80mVt5 为了使膜片去极化，例如，到-30mV，需施加指令脉冲 Vc=-50mV。在实验结束时，通过抽吸打破膜片, 在电流钳模式下可精确测量 VR。如果在实验结束时由于各种原因无法测量 Vr，可以考虑在未知 Vr 情况下报告膜电位。

四、全细胞式

10.建立千兆封接后（步骤 8)，首先将 Vh 和 Vc 设置到适当的值。Vh 通常置于-80mV, 对应于预期的静息膜电位值。指令脉冲 Vc=-30mV。电极电容产生的瞬时电流的快成分已被消除。给予短促的抽吸脉冲可打破膜片从而形成全细胞式，此时会出现大的慢瞬时电流，并且漏电流和电子噪声均增大（图 6-4B, 全细胞模式)。这些改变是由于从细胞贴附式向全细胞式转变时，钳制膜片面积的增加所致。在神经元上成功形成全细胞式的另一个标志是记录到电压激活 Na+电流。

此时，应通过膜片钳放大器的相应电路来补偿慢瞬时电流。在补偿时，要用小的超极化脉冲刺激细胞，因为这不会激活快电导。

注意：全细胞记录时会遇到两个问题：

11.电流钳记录。全细胞式也可以用来进行电流钳记录，此时钳制的是膜电流，而记录的是膜电位的变化。电流钳模式即可用来测量静息膜电位，也可测量突触后电位和动作电位：电流钳与电压钳之间的转换，只需选择膜片钳放大器上相应的按钮即可。

五、外面向外式

12.外面向外式记录由全细胞式而来（步骤 1 〇，电容电流慢成分补偿之前)。Vh 设置于-80mV, 指令脉冲调至 Vc=-30mV。缓慢将玻璃电极拉离细胞，直至失去连接。夕卜面向外式的形成伴随着 Na+电流进行性下降、电容电流慢成分的消失和背景噪声的显著下降。在外面向外式形成后，只有将放大增益增高至单通道记录水平时才能看到离子电流。瞬时电流的快成分需要补偿。’

注意：如果尝试拉成外面向外式膜片不成功，试着在拉另一个膜片时更慢一些。建议将玻璃电极尖端拉离细胞数毫米，以确保不再与细胞膜相连。

六、内面向外式

13.建立千兆封接以后（步骤 8)，首先将 Vh 和 Vc 设置到适当的值。内面向外式时，电极电位施予细胞膜外表面，而膜内表面电位与浴槽电极相同。因而，如果将 Vh 设至+80mV，膜上的电压即为生理电位。指令脉冲 Vc 可以设至+30 mV。之后，小心拉玻璃电极，直至不再与细胞相连。有两种方法获得内面向外式膜片：

(1) 有时，拉玻璃电极可直接导致内面向外式膜片的形成（图 6-1B)。

(2) 然而，在多数情况下会形成小囊泡（图 6-1B)。此时，短暂地将玻璃电极尖暴露于空气中也可破坏囊泡外膜。形成内面向外式后要补偿由于玻璃电极电容充电产生的快速瞬时电流，并应将放大增益调至适用于单通道记录。

如果在含实验标本（如培养细胞或脑片）的浴槽中进行内面向外式实验，会产生―些问题。此时，浴槽中常常以高 K+的内液灌流，可使细胞膜电位去极化到 OmV。长时间暴露于内液可导致许多细胞死亡，或者变得很难封接。因此，在每次进行内面向外式记录后必须将该培养皿或脑片丢弃，即使膜片不含所感兴趣的通道或不能存活到完成整个实验过程也应如此。这在实验中是非常令人失望的，因为：脑片或培养皿数量有限; 从同-的细社需获取数个内面向外式膜片；为封接准备细胞需要额外的时间消耗，如清洁脑片上的结缔组织。

七、多通道灌流系统

使用多通道灌流雜可在不娜标袖慨下进行内輸外式记录（Yellen1982)。由毛细玻璃管制作的灌流通道经硅胶管连接于内含不同溶液的注射器（图 6-6A)。溶液由于重力作用而缓慢向下流动，通过调整溶液的流速，使液体在通道的出口处不会祕雛所娜。娜有細肖外式斷__极尖疆齡插当液体的通道出口处。可翻: 移 g] 玻璃电极尖翻 J 另—个通道巾而更换膜片胞雜 (纖体。内面向外式和外面向外式均可用这种多麵灌流雜，但该系统栖个缺点：①安置多麵灌流系统会占用记录浴槽更多的空间。例如，在脑片实验中，水浸物镜已占据了浴槽中大部分空间，而另增加浴槽的容积也不理想，因为这会降低外液灌流脑片的强度。②通道流出的内液可污染浴槽液。

八、增加浴槽

内面向外式记录也可在新增的小浴槽中进行（图 6-6B,Safronov and Vogel 1995)。该浴槽（含有内液）与主浴槽相距0.2~0.5 mm, 通过标准琼脂桥把二者在电学上连接在一起。充灌两浴槽时要使溶液形成高的凸起液面。内面向外式膜片形成原理与图 6-IB 非常相似。首先，在主浴槽中玻璃电极与细胞膜形成封接，缓慢拉玻璃电极导致囊泡形成。然后，再将玻璃电极快速移动（跳跃）到新增的浴槽中，囊泡由于短暂暴露于空气而破裂，跳跃过程要在解剖显微镜观察下进行^其主要步骤有：

（1）将显微镜聚焦于两槽之间的边界上。为了方便聚焦，在边界上或其附近可用防水笔画一个点或刻一个点；

（2）将显微镜上提 300~400 叫；

（3） 将玻璃电极缓慢移向两槽之间的边界，使电极尖端位于边界附近的焦点中。要注意保持两个浴槽液面的稳定性；

（4）加速移动玻璃电极，使玻璃电极在离开主浴槽时达到最大速率。

通常，跳跃过程中膜片暴露于空气的时间要短于常规玻璃电极拉出后再插入浴槽所需的时间。

该方法允许我们从同一细胞上获取多达 20 个内面向外式膜片。下面是我们实验室利用这一系统获得的结果：
（1）含小囊泡跳跃的成功率高（约 90%)。然而，如果在主浴槽中已经形成内面向外式，其成功率将会下降。

（2）如果在跳跃中囊泡外膜未破，可重复跳跃数次。

（3）有涂层和无涂层的玻璃电极均可以进行跳跃。

（4）在单通道记录过程中，新增的浴槽可用不同的液体灌流。为此，浴槽中需加入两个套管，以便吸出和加入液体。

（5）有时，如果把电极电压从+80mV 降至+60~+40mV 会提高成功率，这可能是由于低电位对的膜应激作用较小所致。跳跃后，再将玻璃电极电位重设为+80mV。

增加一个浴槽来进行内面向外式记录有如下优点：

一新增的浴槽中所需浴槽液体量少（200/J)，因而当使用贵重试剂时非常有益

一浴槽被分开，因而主浴槽木会被内液污染

注意：实验槽的制作材料对于液面凸起的形状和稳定性非常关键。选择疏水性材料可避免跳跃时两个浴槽内液体的混合。Teflon(聚四氟乙烯）是制作浴槽较好的材料，可以形成稳定的凸起液面。但不幸的是，它是种相当软的材料，在浴槽之间制作狭窄的边界需要很高的技术。一种极佳的 Teflon 替代品是 ddrin(聚甲醛，DuPont，France)。与 Teflon 相比，delrin 有更高的机械硬度，因而易于手工制作，但它的疏水性稍差，因而用它制作的浴槽中凸起液面的稳定性稍差。然而，若在 ddrin 制作的浴槽表层涂一薄层凡士林就可以弥补这一缺陷。为此，首先将凡士林涂到浴槽表面，之后用干棉纸擦除，直至无法看到，剩余的凡士林薄层仍然足够维持凸起液面的稳定性。用凡士林覆盖 1 次，浴槽可以使用数月，在每次实验后需用蒸馏水清洗浴槽。

十、结果