显微注射室和显微工具的准备

显微注射室和显微工具的准备

材料

试剂

无 水 乙 醇（9 5 % 和 70%)

盐 酸（1%)

SafetyCoat Nontoxic Coating (JTBaker 4017-01) 或 Sigmacote (SigmaAldrich)

仪器

4in 的 钝 的 不 锈 钢 针（Custom order: Hamilton Co.， Reno， Nevada) 或者纯的18 G 皮肤穿刺针，连着一段内径为 1/32 (0.8in) 软 管（Saint-Gobain PerformancePlastics AJC40001)，软管后面安装固定针。

钻石或金刚石笔

符合 DIC 的光学载玻片（2 5 mmX 75 mm, 预先清洁）

真空砂油（ Dow Corning 1597418)

微型本生灯

用 钝 的 18 G 针来替换燃烧器，调节本生灯使其发出非常小的火焰。

微型毛细管（100ul )

用钻石或金刚石笔，把 毛 细 管 切 成 2 2mm长（每一个显微注射室准备两段)。

微 锻 仪（DeFonbrune^type or Narishige-type) 配有双目的复合显微镜； 10 X 光学目镜，其中一个装有十字千分尺；物 镜 4X 、 IOX 和 20X (长工作距离）

装有箱式的钻丝（2.5 mmX2.5 mm或 3 mmX3 mm) 的 P-87/P-97Flaming-Brown

微电极水平拉针仪（Sutter Instruments, Novato California)

塑料球形移液管（可任意使用）

载玻片盒用作无尘储存器

硅 胶（ GE Silicone II), 真空矽油，或者蜡，把毛细管粘到载玻片

用于固定针的厚壁毛细管（I .Omm OD X 0. 58 mm ID) (World Precision Instruments, Sutter Instruments)

用于毛细针的薄壁单管有丝毛细管（I.Omm OD X 0 •75 mm ID) (World PrecisionInstruments, Sarasota, Florida； Sutter Instruments)

注射器用在硅化时对针产生正压（optional, 见步骤 13)

连 有 6〜8 cm 长 的 软 管 钝 的 18 G 皮 肤 穿 刺 针（1/32[1 〇 ])<3/32[OD]\1/32[wall])(Saint-GobainPerformance Plastics AJC40001)，软 管 连 接 到 20cc 可任意处置的有卡式胶筒盖注射器。

方法_

准备显微注射室

1•用少量硅胶（GESiliconeII) 将一段 22m m 长 IOOul 的毛细管粘到 25m m X 75m m 预先准备好的载玻片上，毛细管与载玻片长边平行，距离边缘 2 m m 。

2 •在载玻片的另一边相同位置沿着边再粘一根 22m m 长的毛细管，在运行的组织培养箱内过夜干燥胶水。

3•用 1 % 盐酸彻底洗净载玻片，用蒸馈水洗几遍，最后用乙醇清洗。

4•用可随意使用的塑料球形移液管在载玻片间隔加硅胶溶液，然后用强流蒸馏水冲洗几次。

SafetyCoat Nontoxic Coating 是最好的，但是 S gmacote 也可使用。

5•把显微注射载玻片在组织培养箱中干燥，为防尘放置于塑料载玻片盒中。
显微工具制作：拉取胚胎固定针

6•在距厚壁毛细管（I. 〇 m m O D X O .58m m I D ) —端 2 /3 处 加 热 5mm长 一 截 ，拉长到30m m , 使管径在 1 〇〇〜150um 。

7.在距离固定针较长一端变细点 10〜15m m 处用金刚笔切割拉长的细管，把长的部分与短的部分间折断。

8.在微锻仪上检查固定针，确保针头是对称的，没有尖或裂缝，确保在显微注射时做好的固定针能把胚胎固定在正确的位置。如果有必要，在微锻仪上用粗丝切断吸管去形成一个对称的面。

9.用微锻仪的粗丝磨平吸管，并把吸管的开口弄细到 15〜20um ，如果有必要，在吸管的凸出部做一个 5°的弯曲以使得固定针能平行于注射室的面进入显微注射滴。

10.用微型本生灯的火焰烤平固定针粗的一端，但注意不能使开口封闭。

显微工具制作： 拉显微注射针

1 1 . 用 S u tte r In s tru m e n ts P - 9 7 微电极水平拉针仪制作显微注射针，使用系统默认的参数 ： H e a t = R a m p v a lu e ; P u ll = 50; D elay = 80; P re ssu re = 200。调节参数制作一 个全长 7〜9m m 逐渐变细的针， 使针管从大约 2( V m 迅速地变到最后的 0. 5m m 。

12•在微锻仪的玻璃珠上轻轻地削尖针尖，使得吸管尖在 0.2〜0.5um (Mann and McMahon 1993) 。

13.可选择的步骤：在削尖吸管尖之前硅化处理显微注射针，以助于减少细胞物质对针尖的黏附性，增加用单针头注射的卵子的数量。操作如下：

a•把针安装到 2 0 c c 的注射器上，注射器连有 IO c m 长的 I D 为 1 / 3 2 的软管。

b•应用注射器的正压，把针尖浸人用 9 5 % 乙醇稀释的 SafetyCoat Nontoxic 无毒涂料中，浸入两次，每 次 5s。

c. 立即用 9 5 % 乙醇冲洗针尖，接着用 7 0 % 乙醇，然后浸人 0. 2 2 um无菌过滤的蒸馏水中。

d. 干燥针尖，然后按步骤 12 描述在微锻仪上削尖。

对固定针和显微注射针的角度调节

14.在使用 Leica-型显微操纵仪时不要求在拉完显微注射针和固定针后进一步调节角度。在使用 Rail-Mounted Narishige-型显微操作仪时，有必要把显微操作针和固定针的针头做成 30°〜35°的弯曲，以使得针尖能平行于显微注射室进入显微注射 滴 。

准备显微注射的 DNA

材料

试 剂

琼脂糖凝胶

乙 酸 铵（5m ol/L )

DNA 显 微 注 射 缓 冲 液（l 〇 m m o l/L T ris-H C 1 p H 7. 5 、 0•lm m o l/L E D T A 、注 射 用 水 满 足 所 有 U SP M o n o g ra p h 要 求 [W F I; Invitrogen ])

使 用 0• 22um 的 SFCA 无 菌 滤 器 过 滤（Millipore)。

乙 醇（1 0 0 % 和 9 5 % )

酚 ：氯仿

质粒

用于消化质粒的限制性内切核酸酶

蔗糖溶液

1 0 % (m/V ) 和 4 0 % (to/V ) 溶 于 lm ol/L 的 NaCl 中、 10 mmol/L Tris-HCl pH 8. 0、lm m ol/L EDTA 用 W F I 水准备。使 用 〇.22fzm 的 SFCA 无 菌 滤 器 过 滤（Millipore)。

T E 缓 冲 液（10m m o l/L T ris-Cl p H 8. 0 ， lm m o l/L E D T A )

仪器

Centricon-IO O 微 型 浓 缩 机（A m e rsh a m )

梯 度 形 成 仪（如 S G 30 g ra d ie n t fo rm e r; A m e rsh a m )

低 流 动 性 蠕 动 泵（〇 •0 3 〜 8. 2m l/m in ) (Y W R S cien tific)

微 型 离 心 管（I .7m l，无 菌）

若必要，用 〇.22um的无菌过滤器滤去内毒素的蒸馏水除去尘埃粒子。

针（25 G )

橡皮塞

橡 皮 塞 要 有 18 G 的皮肤穿刺针从塞子的中心由上到下穿过，并且要很适合超速离心机的上部。

超 速 离 心 管（B eckm an U ltra -C le a r 344060)

超 速 离 心 机 和 翻 斗 式 超 速 离 心 机 转 子（如 S W 40 T i ; B eckm an-C o u lte r)

方法

1•用限制性内切核酸酶切割 50ug 质粒，从质粒上释放转基因插人片段。黏 粒 DNA 在纯化前用限制性内切核酸酶线性化。

2•用酚：氯仿抽提，然后用 1 倍体积 5m o l / L 乙酸胺、 2. 5 倍体积的 1 0 0 % 的乙醇沉淀，13 O O O g 离 心 30m i n 以上，然后用 50 ug T E 缓冲液悬浮。

3•按照密度梯度形成仪的说明在超速离心管中倒入两份线性的 1 0 % 〜4 0 % 的蔗糖密度梯度，总体积大约 14 ml。

4•在一支密度梯度离心管中加入切割的 DNA，使用另一支密度梯度管分离其他片段或者作为平衡。

5.用显微注射缓冲液精确地平衡蔗糖密度梯度管，质粒切割片段在 4°C , 35 OOOr/min离心 4 h; 黏 粒 35 000r/min 离 心 24 h。

6 . 当超速离心机离心速度开始下降时在架子上放置 8 0 个灭菌的无菌的 I.7m l 的微型离心管，在超速离心管的上部插人橡皮塞/针，从鹿糖密度梯度上部移走大约 2m l 包含DNA 的液体。

7•把手指放到塞子上开放的位置，然后把 25 G 的针推进超速离心管的底部， 25 G 的针头进人密度梯度液要小于 5 mm。用塞子上的针控制流速，在每个收集管内收集大约0.2m l 的小片段。

8.每 4 个收集管用琼脂糖凝胶取一个 5ul等份，确认第一个收集管和最后一个收集管仅包含转基因插人片段。对所有的收集管重复凝胶分析，在凝胶的两边点样孔中分别加人载体+ 插人片段及插入片段。

9•合并所有的仅包含转基因插入片段的收集管，使 用 Centricon-IOO 微型浓缩机用显微注射缓冲液进行 5〜7 次连续的缓冲液的改变。对于质粒，收率是开始时 DNA 总量2 5 % 〜5 0 % ，对于黏粒是 1 0 % 〜2 5 % 。

1 0 . 用分光光度剂精确地测量 D N A 的浓度，在琼脂糖凝胶上分析小样本，同相似大小的标准比较。

11.4°C 存储浓缩的 D N A , 用显微注射缓冲液将 D N A 稀 释 至 2 〜 3ug/ml。 在灭菌的、无尘的微量离心管中准备几个 1 〇〇 4 等份的 D N A 为显微注射用。 4°C 至多储存一周。备用 D N A 能在一 20°C 下冷冻，但在显微注射稀释时要小心地完全悬浮 DNA。

超数排卵和胚胎采集

材料

试剂

IV -S 型 牛 睾 丸 透 明 质 酸 酶（l 〇 m g /m l; S igm a-A ld ric h ) 在 M 2 中（储存液 4 0 X )

在一 20°C 储存等份。使 用 前 用 M2 稀 释 至 250ug/ml。

CO2 用于胚胎供体小鼠安乐死（备选，见步骤 4b)

胚胎供体小鼠

人绒毛促性腺激素（H G G ) (Sigma-Aldrich)

用灭 菌 的 〇 • 9 % 生理盐水稀释至 500IU/m l，一 80°C 储 存 0 • I m l 的等份最多 6 个月。

轻 矿 物 质 油（Sigma-Aldrich，用于毒性或胚胎试验的配对检验)。
在松的带盖瓶中在游箱中保存 30〜40 ml 矿物质油，使用这种「平衡，，矿物质油去覆盖 CZB

(一) 培养液。

培养基

C Z B 培养基：无葡萄糖的碳酸氢钠缓冲液胚胎培养培养基，用做所有的单细胞胚胎培养，不 分 品 系（ChatotetaL 1989)。用 盐 和 灭 菌 的 无 内 毒 素 的 H 2O 准 备 储 存 溶 液（Nagyetal.2003)。

M 2 培养基： H E P E S ■缓冲液胚胎悬浮培养基（Quin n etal. 1982 ) 。 用灭菌的除内毒素的蒸溜 水 准 备（N a g y et al. 2 〇 03)或 者 购 买（Sigma-Aldrich of Specialty M e d ia/Chemicon ， Temecula ， California) 。 其 他 的 小 鼠 胚 胎 培 养 基（K S O M - A A , M 1 6 ) 能 购 买（ Specialty
Media/Chemicon) „

孕马血清促性腺激素(PMSG) (如 Sigma-Aldrich 或 the National HormonePeptide Program [Dr.A.F.Parlow, Harbor UCLA Medical Center, Los Angeles, California]) „

用 0. 9 % 的灭菌生理盐水，准 备 500IU/m l 的储存溶液，一 80°C 储存灭菌的 0. ImI 等份最多6 个月。

生 理 盐 水（0 . 9 % ，灭菌）作为注射前稀释激素的储存液

仪器

浮箱，事先调到 37°C (humidified， 5 % CO2)

嘴吸管用做胚胎固定

16〜18in 的 橡 胶 管（1/8X3/16X 1/32) —端连接 10(^1 的毛细管，将附隔离塞吸管尖头尖嘴 切 去 2 —— 3mm ，将其插到橡胶管的另一端，用作胚胎固定针的巴斯德吸管大的末端安到大的附隔离塞吸管尖，另一端为嘴吸管（HPIHospital Products, Apopka, Florida)。
皮氏培养皿（3 cm)

在不同的培养液间移动胚胎时均可照明的立体变焦显微解剖镜（如 Leica MZ7. 5)

钟表钳子（Cumont no.5 ) (两副），细 解 剖 剪（一副）（ World Precision Instruments; Roboz Surgical Instrument Co.， Inc.， Gaithersburg， Maryland)

方法

胚胎供体小鼠的超数排卵

1.一般用在原核显微注射实验中来源于小鼠系的雌鼠在开始源发性的发情周期 3〜5 周龄前超数排卵，一些品系的小鼠在开始源发性的发情周期后对激素的反应更有效。

2.PMSG 的标准剂量是 5I U /小鼠，在光循环开始后 6〜IO h 后由腹腔注射给药（如下午 12点至下午 4 点并在下午 6 点开灯)。对于有些品系的小鼠增加或减少 2.5IU/小鼠，会工作的更好。

3•在 PMSG 注射 46〜48 h 后通过腹腔以 5IU/小鼠的剂量注射 HGG 刺激排卵。 HGG的剂量一般要与早期注射的 PMSG 的量相匹配。在注射了 HCG 后胚胎供体雌性小鼠与能繁殖的雄性小鼠立即配对。来源于自交系的雌性小鼠（如 C57BL/6J) 正常受精卵的产量可以提高，当其在注射 HCG 4〜6 h 后不与雄性配对。检测超数排卵的雌鼠阴道内交配栓是交配发生过最强的证据。

4.受精的单细胞胚胎的恢复与维持按如下描述进行

a.准备 4 个 3 cm 的皮氏培养皿，每个包含 5 排 5 个 10ul的 CZB 胚胎培养液滴，标上（「Washl」、 「pre」、 「Wash2」 和 「Injected」），用矿物油覆盖，置 于 咖CCV95% 空气的细胞培养箱平衡。在接种胚胎前让平皿在组织培养箱内平衡大于 3Omin

b. 经过中间暗周期 10〜12 h 后 ，用吸人CO2 的方法安乐处死胚胎供体小鼠，或者通过颈椎脱位法。

c•解剖每只小鼠的输卵管，小心不要撕开被堆积物质包围的包含单细胞卵的子宫胫。

d. 在 H E P E S ■缓冲的胚胎悬浮培养基 M2 中冲洗每只小鼠的输卵管壁。

e. 准备 0 ■ 5m l 包含大约 250 ug/m l 的 IV-S 型牛睾丸透明质酸酶的胚胎处理培养基。

f. 从每只小鼠的输卵取堆积物，放人包含透明质酸酶的 M2 培养基滴中，用钟表镊子过撕开子宫胫。

g. 在含有透明质酸酶的液滴中搅动堆积物，直到堆积细胞消失。收集卵细胞，立即用不含有透明质酸酶的 M2 培养基冲洗。动作要快。

h.在 「Washl」培养皿中通过 6 滴冲洗 40〜6 0 组胚胎，然后放一滴在「Pre，，培养皿中，转移胚胎到 CO2 孵箱中。原核在经过中间的暗周期 10〜14h 将变得清晰可见，显微注射应在检测到原核后尽可能快地进行。

显微注射

材料

试剂

用于显微注射的 D N A 溶 液（准备见方案 2)

用做显微注射的受精卵（准备见方案 3)

氣（Sigma-A ldrich )

氟用来加胚胎固定针当用油加显微注射器。

真 空 砂 油（D o w C o m i n g 1597418)

M 2 培 养 基

包 含 C Z B 培养基滴的皮氏培养皿（方 案 3 的步骤 4a 中 准 备 的 「 W ash 2 」 和 「 Injected 」 培养皿）

仪器

吸水纸

盖 玻 片（22 mmX22 mmXlmm)

胚胎固定针（准备见方案 I)

倒 置显微镜（高质量）有 4 X 明视场， IOX 明视场， 3O〜40X D IC 或 者 HoffmanModulation contrast optics 用作显微注射（如 LeicaMicrosystems, Wexlar, Delaware； NiKon USA, Melville, New York； Olympus America Inc., Melville,New Yord； Carl Zeiss Imaging Inc., Thornwood, New York)

2 6 mmX 7 6 mm X 1. 5m m 的槽加工为显微镜座插人物的中心，以精确的线性固定着显微注射室 。 6 0mm或 IOOmm 的皮氏培养皿的盖子能与霍夫曼调制相差光学镜一起使用。

手动显微注射器控制胚胎固定针的吸入（如 Eppendorf， Narishige)

显微注射室（准备见方案 1)

显微注射针（准备见方案 1)

一对显微操纵器（左和右）

机 械 的 显 微 操 纵 仪（Leitz) 要求一个带有轨道的底座平面，液 压 的 显 微 操 纵 仪（NarishigeInternational, New York) 要求有轨道，上面配有显微镜。

巴斯德移吸液管（灭菌的）

吸管架/工具袖

充气防震管（Kinetic Systems Inc. ， Boston, Massachusetts)

充气显微注射器 械（如 Femtojit Eppendorf AG， Hamburg)

用来从显微注射针移走泡注射器

连着 6〜8 cm 长 的 软 管（1/32IDX 3/32 O D X 1/32 wall ) (Saint-Gobain Performance PlasticsAJC4 0 001) 的、钝 的 18 G 腹腔注射针，软 管 连 接 到 20cc 有卡式胶筒盖可随意使用的注射器上。

U V 分光光度计

方法

构建显微注射滴

1.若在方案 2 准备的 2ug/ml DNA 溶液被预先冻好，彻底地混合它以保证 DNA 被完全地溶解。用紫外分光光度计检查溶液的浓度（A260)。

2 . 4℃， 14 000 g•离心 DNA 溶液 30 min，置于冰上。

3.用真矽油填充显微注射室（准备见方案 1 ) 上部毛细管的两个空间，吸取 300〜400ul的 M 2 培养基滴到间隔间，形成椭圆滴。在上面放一个盖玻片，轻轻地推使密封。在液滴周围填充轻质矿物质油（图 1 ) 。

4 . 用氟填充胚胎固定针，插针进人工具袖，其与微注射器相连。把工具袖放入显微操作仪。

5 . 调节固定针的角度，以便使针尖与显微注射室的表面平行。

6.用一张吸水纸盖住显微镜台座空白地方，防止液体从固定针流出，滴进显微镜目标。

7•拉一个灭菌的巴斯德吸液管到 10〜12c m 长，直径大约 0 •15m m ，从上层吸取 D N A溶液，避开颗粒物质。把加样针插入显微注射针的凸部，吸 取 2〜5ul D N A 溶液。

8.DNA 溶液不会从注射针内流出，直到所有的气泡被移走。这个过程能通过使用下面方法显著的加快。

a•安装 20cc 注射器，注射器连有橡胶管，橡胶管上有塞子，将针粗末端插入塞子。

b. 弯曲橡胶管，以使针尖向下，运用轻轻拍打针尖时产生的正压驱除所有气泡。

9.把显微注射针插入工具袖，把工具袖放人显微操作仪。工具袖应该与显微操作仪的固定夹成一排，以便显微工具被作为中心，恰好与显微注射室的长轴平行。调节工具袖的倾斜度，以便显微注射针几乎与显微注射室的表面平行。

10•调节充气的显微注射针的注射压（Pi) 到 70〜 IOOhPa, 固 定 压（Ph) 到大约5 0 % Pi。

11.提升在显微操作室的工具袖直到针尖距离显微注射室的边缘大约 2 mm，然后拧紧固定夹。

12.用几滴轻矿物质油下的 M2 培养基冲洗保存在 37°C ， CO2 孵箱中 CZB 微滴中卵子。

1 3 . 从显微镜底座移走显微注射室，在 M 2 滴中心的垂线上沉淀卵子，从液滴的中点开始 ，延伸到顶部。

1 4 . 在低放大率下，向前推进固定针和显微注射针，直到它们与胚胎一样在一个小的视角内可见。保持固定针与注射针分离，以免损坏针尖。

1 5 . 旋转到 IOX 物镜，调节固定针和显微注射针的高度，直到它们与胚胎在同一个焦平面，重复调节直到最大的放大率。

1 6 . 固定针尖应几乎触及注射室的表面，应与胚胎在同一个焦平面。调节固定针的角度与 f 面斜度，以使固定针移动没有明显的震动。

原核显微注射

1 7 . 用固定针吸起一个卵子，在高放大率下检查。在一个受精卵中应该仅有两个原核是可见的，在原核内有一个或多个核仁。单个原核暗示着卵子没有受精，卵子内有大于 2 个原核则其不能正常发育。

1 8 . 焦点对准显微注射针，当充气注射器的注射功能激活时，在针尖找一个非常小的旋涡液滴。若没有见到，或许有必要轻轻地把它推进人固定针轻打开针尖。若启动注射功能时在针尖产生一个大的旋流，注射针会引起过量的卵子溶解。如 果 DNA 溶液缺乏或过量在进行前换针。

1 9 . 调节卵子的位置，以使较大的原核和固定针的针尖都在准聚焦。
靶原核应该位于卵子的中心附近，卵子的质膜会很难穿透。理想的，原核将被定位，以使显微注射针在刺穿质膜时不会碰到任何的核仁。

20.确保胚胎被固定针牢牢地固定，然后放置注射针直到针尖直接在靶原核的下面(6 o’ clock) , 调节针的高度（2 轴）直到显微注射针和原核膜恰在同一焦平面。原核膜看起来像一条好的环线，核仁通常也在准焦平面内。显微注射针尖可能很难清晰地看见，因此调节针的高度，直到上下边缘锋利可见，然后在针尖处合并为一（图 2 , 见彩版)。

21.把针尖放在原核相反的方向，瞄准没有核仁的区域，推进透明带和质膜，以一个单一平稳运动进入原核。一旦当穿刺针穿透透明带与质膜时，卵子的表面会收缩，然

22.如果针不能刺穿卵子质膜或者原核膜，小 的 「气泡」会出现在针尖。如果这种现象发生，从卵子抽出针尖，把原核膜和针尖放到焦平面，重复显微注射过程。

2 3 . 进行显微注射，用 5〜6 滴 CO2 平衡了的 C Z B 培 养 基（「 Wash2」 培养皿）冲洗注射的卵子，培 养 60 min ( 「Injected」 培养皿）去评估生存率（这些培养皿是在方案3 的步骤 4a 中准备的）。

显微注射后卵子的成活，依赖于个人的技巧及所用的小鼠的品系。典型的，大 于 9 0 % 的卵子在显微注射过程中成活。

胚胎移植

材料

试剂

麻醉剂

已经显微注射的卵子/胚 胎（如方案 4 中）

理想地，经过一个简短的接种显微注射过程存活的卵子移植到〇.5dpc (days postcoitus) 假孕受体雌性小鼠体内。如果得不到雌性受体小鼠，体 外 在 CZB 培养基中培养卵子到多细胞胚胎阶段。

受体雌性小鼠

使 用 6〜9 周 龄 的 杂 交 （如 F1 或 F2 C57BL/6XCBACa/J) 或者远交品系。

输卵管结扎雄性小鼠

仪器

玻璃移液吸管 （120〜150u m )

揭开假孕受孕小鼠生殖管的工具

立体变焦解剖显微镜光纤照明用做外科胚胎转移 （如 Leica M Z 7 .5)
手 术 针 （9m m )

方法

假孕受孕雌性小鼠的准备

1.在胚胎移植手术进行的前一晚上，雌性受体与结扎输精管的雄性小鼠配对。

2 . 在第二天中午 12 点前，检查雌性小鼠阴道是否存在交配栓。
发现有交配栓的雌鼠终止 0 • 5dpc, 因为交配在暗周期中发生了。
把胚胎移植到假孕受孕受体小鼠

3 . 麻醉一个 0.5d p c 的假孕受孕雌性小鼠，准备无菌外科手术，通过腹部中央切割手术取出一边的生殖管道。

4 . 把卵子/胚胎加人一个 120〜150um 的玻璃移液管中，打孔或小心地撕开卵巢囊，出血最少，把卵子/胚胎移植到子宫囊口。

5.若有必要，剪开另一侧的腹腔及生殖道，重复上述操作。

6•用 9 mm 的手术针把切口缝起。

根据经验，显微注射胚胎的 20%〜40% 产生活胎，因此，移 植 大 约 30 个胚胎到雌性受体,会产生合适的数量。