ELISA检测筛选到的靶分子结合肽
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ELISA 检测筛选到的靶分子结合肽
【材料和试剂】
（1）酶标板，酶标仪
（2）湿盒
（3）吸水纸
（4）LB培养基
（5）PEG/NaCl
（6）TBS
（7）0.1M NaHCO3（pH 8.6）
（8）HRP底物缓冲液
ABTS贮存液：在100ml 50mM的柠檬酸钠溶液（pH 4.0）中溶解22mgABTS，过滤除菌贮存在4℃。
【操作步骤】
（1）噬斑扩增上清部分用于DNA序列测定，其余保存于4℃。
（2）将ER2537接种至20ml LB培养基中，37℃孵育至轻微混浊，或将过夜培养的ER2537按1：100稀释至20ml。
（3）加入5ml噬菌体上清，37℃剧烈通气培养4.5h。
（4）将培养物转入离心管，10，000转离心10min。取上清转入新的离心管，再次离心。
（5）吸取上层80%的上清转入新离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃沉淀1h或过夜。
（6）4℃，10，000转离心PEG沉淀物15min。倾去上清，再次短暂离心，吸去残留上清。
（7）用1ml TBS悬浮沉淀物，并转至微量离心管中，4℃离心5min以沉淀残留细胞。
（8）将上清转至新离心管中，再次用1/6体积的PEG/NaCl沉淀噬菌体。冰上孵育15~60min，4℃离心10min。倾去上清，再次短暂离心，吸去残留上清。
（9）用50ml TBS悬浮沉淀物。测定滴度，贮存于4℃。
（10）取100~200ml溶于0.1M NaHCO3（pH 8.6）的100mg/ml靶蛋白包被酶标板的加样孔，在密封的湿盒内4℃孵育过夜。每一个克隆包被一列。
（11）倾去靶溶液，并将板子反扣在吸水纸上尽量吸干。在每一个孔中加满封闭缓冲液。另外，每个克隆都需要封闭一列未包被的加样孔，以检测其与BSA包被板子的结合。封闭另一个酶标板用来稀释噬菌体，这样可以保证稀释过程中噬菌体不被靶蛋白吸收。4℃封闭1~2h。
（12）倾去封闭液，用1´TBS/Tween洗涤板子6次，每次都将酶标板反扣在吸水纸上尽量吸干。Tween的浓度应该与筛选洗涤步骤的浓度相同。
（13）用TBS/Tween 4倍比稀释噬菌体，200ml/孔，第一孔为1012颗粒，第十二孔为2´105颗粒。
（14）用多道加样枪，将每一列倍比稀释的噬菌体转至靶蛋白包被的酶标板内。室温振荡孵育1~2h。
（15）用1´TBS/Tween洗板6次。
（16）用封闭缓冲液稀释HRP标记的抗M13抗体，稀释度为1：5000，每孔加入200ml，室温振荡孵育1h。
（17）用1´TBS/Tween洗板6次。
（18）制备HRP底物缓冲液。ABTS贮存液：在100ml 50mM的柠檬酸钠溶液（pH 4.0）中溶解22mgABTS，过滤除菌贮存在4℃。使用液要新鲜配制，在21ml ABTS贮存液中加入36ml 30%H2O2，用于一个酶标板。
（19）每孔加入200ml底物缓冲液，室温孵育10~60min。
（20）酶标仪检测405~415nm处的OD值。
