肽库的筛选方法
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2208
肽库的筛选方法
噬菌体肽库 筛选总的指导思想是利用有些生物大分子之间存在着不同大小的亲和力，以生物大分子为靶目标，通过直接或多轮筛选可以从肽库中筛选得到相应的且具有特定亲和力的结合肽。噬菌体肽库筛选方法一般采用生物学筛选技术，又称为生物淘洗(biopanning)，即利用生物操作方法从噬菌体随机肽库中筛选出所需的噬菌体肽。筛选方法可以因筛选靶目标的性质、筛选的规模而不同，并且与操作人员的习惯有关。
经典的筛选方法主要分为固相筛选法和液相筛选法。其中固相筛选法中常用的有两种方法：一是将靶分子直接包被在固相支持物上，如聚苯乙烯平板或酶标板，加入肽库收集结合的噬菌体。这种方法简便易行，成本较低，并可同时对多种靶分子进行筛选。另一种方法是将目标蛋白结合在颗粒载体上，如与树脂颗粒共价交联，然后至肽库中筛选。其优点是在单位面积载体上可吸附更多目标蛋白。但固相筛选法的缺点是靶分子在固定过程中容易发生构象改变，尤其对构象不稳定的靶分子影响更大。液相筛选法正是针对这一问题而发展起来的，通常是将生物素标记目标分子，在溶液中与肽库混合并发生相互作用，然后将混合物加至固相化的亲和素中，通过生物素与亲和素的结合，达到富集高亲和力噬菌体肽的目的。近年来已发表了多种改进的筛选方法，如pH梯度洗脱法和密度梯度离心法等，其原理都是基于这两种基本筛选模式发展出来的。
在肽库中，展示每一种多肽的噬菌体拷贝数是有限的，如一个6肽库的库容量为108 ，筛选滴度为101’，这就意味每一种多肽的噬菌体平均拷贝数为1 000。如果这个肽库中只有1种多肽是与目标分子结合的话，那么该多肽在库中也只有1 000个携带噬菌体(1／108 )。第一轮的亲和筛选是非常关键的，如果没有获得该噬菌体克隆也就注定以后筛选的失败。由此可见，在筛选过程中的操作方法是很重要的。
在整个筛选过程中，涉及两个重要因素：回收率和选择强度。所谓回收率(yield)，是指在每一轮亲和筛选中，洗脱获得的噬菌体克隆数与加入的噬菌体克隆数之比。所谓选择强度(stringency)，是指各种实验因素对目标分子与噬菌体多肽之间结合的影响。选择强度越高，获得的阳性克隆的亲和力越高。淘选实验中影响选择强度的实验因素有多种，其中很重要的是加入目标分子的用量。一般加入的目标分子浓度越低，选择强度越大，则获得的噬菌体肽的亲和力往往较强。还有就是洗脱强度包括洗涤时间、洗脱液的pH值或竞争性洗脱时竞争剂的用量等，都明显影响筛选肽的亲和力。当然随着选择强度的提高，回收率将会随之降低，这是一对矛盾。为了在这两者之间取得平衡，通常解决的方法是：第一轮筛选时主要是富集相关的肽序列，最重要的是获得较高的回收率。在实际操作中，第一轮的亲和筛选经常是加入高浓度的目标分子，延长目标分子与噬菌体多肽作用的时间，并降低洗脱的条件，以获得第一轮筛选较高的噬菌体滴度。而第二、三轮的筛选目的主要是从中筛选出高亲和力的噬菌体克隆，主要强调选择强度，可以采用降低目标分子的投入，提高洗脱强度甚至采用竞争洗脱的方法，增加目标分子与多肽之间的结合压力，从而筛选到亲和力高的多肽。因为第一轮淘选时，阳性克隆在原始肽库中的比例和数量很低，若选择强度过高，极易导致阳性克隆的丢失，这在后几轮筛选中是无法弥补的。经过第一轮淘选后，噬菌体经过扩增，阳性克隆的数量和比例将大大增加，因此在随后的筛选中，主要是从中获得高亲和力的多肽，即使加大选择强度，阳性克隆的丢失概率也大大降低了。如果用单抗筛选，通常在第一轮淘选时使用的蛋白浓度较高(如1～10 Ug)，而在后几轮筛选过程中则降低抗体浓度(如1ug以下)。
在整个筛选过程中，还要注意不同噬菌体的生长速度是不同的。1999年，Rodi和Makowski已经指出，在噬菌体肽库中不同噬菌体克隆之间存在着严重的生长竞争现象，每一轮筛选后的扩增会由于噬菌体克隆之间的生长竞争而导致一些亲和力高但生长缓慢的噬菌体克隆被淘汰。目前为了解决这个问题，已经有些改进的方法。例如：在筛选后的扩增采用固体培养的方式以代替液体培养，收集并混合这些分开的噬菌体克隆或噬菌斑后，再进行下轮的筛选；或者在第一轮筛选后进行固相培养的噬菌体克隆或噬菌斑上直接进行鉴定筛选。当然这些方法操作比较麻烦，至今还没有更好的解决方法。
经过多轮亲和筛选，也不能排除非特异性噬菌体克隆的存在，因而就需要进一步将阳性克隆单克隆化，挑选单个克隆以确定其与目标分子特异性结合的能力，这是必不可少的实验步骤。通常采用的方法是免疫分析技术如ELISA。
从噬菌体肽库技术诞生以来，用于筛选的靶目标主要有3种形式：游离的生物大分子、细胞表面蛋白以及动物体内组织细胞表面的蛋白质。其中报道最多的是利用蛋白质分子如抗体，还有一部分是通过培养细胞的体外筛选法来研究蛋白质之间的相互作用。至1996年，Pasqualini和Ruoslahti创造性地利用动物模型进行了体内的筛选，并筛选出了特异结合脑和肾的噬菌体结合肽，由此建立了噬菌体肽库的体内筛选方法。从理论上讲，体内筛选法尤其在筛选组织或肿瘤组织特异性结合肽时有其明显的优越性：其一，噬菌体肽库进人机体的血液系统，在血液循环过程中可以去除大量与靶组织无关的噬菌体肽，经过多次重复操作后可以得到所需的组织或肿瘤特异性结合肽；其二，在体内筛选到的是自然状态下的组织或肿瘤特异性结合肽，最可能保证筛选出的黏附肽在体内的导向活性，这在诊断和导向治疗中更有使用价值；其三，用体内筛选法经常能筛选到与肿瘤新生血管特异性结合的多肽，而肿瘤新生血管壁上存在着正常血管所没有或很少有的黏附分子，如整合素(integrins)、地址素(addressin)等，这些分子与肿瘤抗原相比其异质性和调变要少得多，也无须克服肿瘤的生物屏障，因此作为导向治疗的“弹头”有更多的优越性；再加上杀死1个血管内皮细胞就等于杀死100个实体瘤细胞，因为没有新生血管肿瘤会缺少营养而生长减缓或坏死。因此将它们作为导向治疗的靶位点将起到事半功倍的效果。从理论上看，体内筛选法有其优势，但体内筛选法在筛选和鉴定方面都比体外筛选法来得麻烦和困难，因此大多数报道还是采用分子和细胞的体外筛选法。
