多维色谱
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1809
多维色谱
在很多情况下，利用，色谱处理蛋白质时，要在分离前把蛋白质消化成多肽。这样处理的好处是肽在很多溶剂中更加易于溶解(特别是膜蛋白的肽)，因而比母体蛋白质更容易分离。缺点是需要处理的肽种类会有一个数量上的巨大增加。在偶联柱分馏之后，馏出物直接送到质谱仪器，样品可能会因其复杂性太高而不能进行合适的分析。虽然质谱技术在快速进步，但是它的动态范围测量能力还是比哺乳动物细胞表达蛋白质的范围低2～3个数量级。在最早的一份报道中，Opiteck等人(Opiteck，Lewis和Jorgenson，1997；Opiteck等，1998)报道了一个用于Z．coli蛋白质作图的二维HPLC系统，这个系统先是尺寸排阻色谱(size exclusion chromatography，SEC)，然后接着是RP―HPLC。可能最成功的处理系统之一是Yates和其合作者报道的系统(Yates和co-workers 1997；Link等，1997；Washburn，Wolters和Yates，2001)，他们开发了一种联机的与RP―HPLC偶联的二维离子交换柱，这个命名为MudPit的系统分离了来自酵母的80S核糖体的胰蛋白酶降解产物。将这些酸化的肽混合物先装进一个强阳离子交换柱(strong cationexchanger，SCX)中，将不连续的洗脱组分载人RP柱，而后将RP的洗脱产物直接载人质谱仪。在SCX柱床逐渐增加盐浓度梯度，而RP珠(采用典型的Cl。)逐渐增大有机溶剂浓度，这个迭代的过程反复处理12次。在全部酵母溶解产物中，MudPit策略能够让人们识别出大约1500个蛋白质(Washburn，Wolters和Yates，2001)。类似的处理过程也曾用于分离人血浆滤出液(Raida等，1999)、血浆(Richter等，1999)、血液超滤液产物(Schrader等，1997)和尿液(Heine，Raida和Forssmann，1997)中的蛋白质和肽。Davis等人(2001)曾经用同样的系统(SCX后接G。―RP)分离来自于人肺纤维细胞的条件培养基的酶解产物。但最精致的仪器可能是Unger和其合作者设计的处理分子质量小于20kDa蛋白质的分离系统(Wagner等，2002)。这种分离系统包含两个梯度HPLC仪器、两个紫外探测仪、1个单元泵、4个RP柱和离子交换柱、4个10孔阀、1个注射阀、两个馏分收集器仓和1个控制这个完全自动系统的工作台。这个系统曾用于分离人血滤液和人胎芽细胞的溶出产物。另外，也有一些包含偶联仪器的其他杂交系统，如一个HPLC连上电泳器械，特别是毛细管电泳或等电点聚焦电泳，甚至等速电泳(Chen等，2001；Wang等，2002；Mohan和Lee，2002)。对于这些，编者建议读者参考相关的文献(1ssaq等，2002；Issaq，2001；Shen和Smith，2002)。有时候，二维系统可以简单地将一个一维的分离系统偶联上高性能的质谱探针来实现。Shen等人的工作(Shen等，2001)就是这方面的一个很好的例子：第一维的分离系统是反相液相色谱(reversedphase liquidchromatography，RPLC) (这个系统基于疏水参数而实现分离)，然后将之直接偶联到傅里叶转换离子回旋共振质谱仪(Fouriertrans―formioncyclotron resonance mass spectrometry，FTICR-MS)上。对于这个偶联系统来说，单次运行需要大约3h，可以分离多于100 000种的成分，这确实是个给人深刻印象的成就。超过1000种可溶的酵母蛋白质可以从超过9000个肽数据库搜索的“命中物”(hits)中鉴定出来，而且只使用了全部40pg的样品，仅在一个单个、高效的毛细管RPLC-FTICR-MS中运行了3h(Shen等，2001)。
细胞溶质胰蛋白酶消化的高效毛细管RPLC-FTICR-MS和其对于特别复杂混合物(检测到的组分多于105 )的超级分辨率
