蛋白质组学经典的基子凝胶的方法
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蛋白质组学经典的基子凝胶的方法
从历史观点上来说，蛋白质组学与利用二维凝胶电泳技术的大规模蛋白质鉴定和质谱紧密相关，其中电泳作为分离方法，质谱作为后续的分析工具。尽管这种方法已经不能涵盖在复杂的生物样品中发现的所有蛋白质，但是它依然在相当多的实验室中使用。在这种处理方法中，蛋白质样品应遵从于二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D―PAGE)的高分辨率和分离能力。二维凝胶电泳是由O’Farrel(1975)、Anderson和nderson(1982)、Scheele(1975)和Klose(1975)等人独立开发的。已经证明，对于毫克到微克的样品量，这项技术可以在一次分析中分离多达10 000条的肽。蛋白质首先变性，然后进行称为等电聚焦(iso electro focusing，IEF)的第一个分离步骤，根据这些蛋白质的等电点(pI)可以分离这些蛋白质。简单地描述就是，在pH梯度胶上的蛋白质会聚焦在pH对应于净零电荷的位置。然后将等电聚焦的凝胶放在二维的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上，根据蛋白质的相对分子质量进行电泳分离(Lammli，1970)。2D―PAGE模式可以通过超敏感染色方法，如考马斯亮蓝染色(Neuhoff等，1988)、银染(Rabilloud，1990)或负离子锌染(Fernandez―Patron，Castellanos-Serra和Rodriguez，1992)等，使蛋白质永久地显现出来。得到的二维聚丙烯酰胺染色胶可以数字化，并且可以计算分析。已经发展了很多图像分析程序来完成这项任务，如2D―PAGE图像可视化、斑点检测、斑点定量化、图像和斑点匹配、图像比较、聚类分析和数据管理。这些年来已经开发了很多软件包，这些软件包覆盖了部分或所有上述功能，值得推荐的有： TYCHO(Anderson等， 1981)、ELSIE(Olson和Miller，1988)、GELLAB(Lemkin，Wu和Upton，1993)、PDQUEST(Monardo等，1994)、Z3(Smilansky，2001)和Melanie(Appel等，1997a，b)。
经典的基于凝胶的方法
下一个步骤就是利用质谱鉴定蛋白质。将目标蛋白质斑点从2D―PAGE胶上切离，然后经内切蛋白酶解消化(最常使用的酶是胰蛋白酶)，然后蛋白质可以从高分辨率的MALDI-TOF仪器上得到的PMF图谱中加以鉴定。MALDI-TOF仪器至今仍然广泛使用，因为它可以高通量地测量PMF图谱。最后将提取的PMF图谱峰提交至专门的鉴定工具，如Aldente(Tuloup等，2002)、Peptldent(Binz等，1999b)、MS-FIT(Clauser等，1995)和Mascot(Perkins等，1999)等。如果PMF的结果不能提供明确的答案，或者没有能够鉴定出蛋白质，不论在质谱测定前是否对肽进行了初步分离或色谱分离，都可以再将肽的混合物提送到一个MS／MS仪器。然后将MS／MS图谱传送到能够读取这些数据的专门工具，如Mascot(Perkins等，1999)、Sequest(Eng，McCormack和Yates，1994)或其他类似的工具。在得不到成功鉴定的情况下，MS／MS数据可以传送至从头测序的工具，这样的目的是不必将实验数据与序列数据库的序列进行比较，而直接从MS／MS图谱中抽取序列的信息。
因为技术本身和样品的复杂性、蛋白质的性质或不同实验室所用的仪器等固有的局限，目前已对这项技术进行了多种改进。
作为2D―PAGE的替代技术，1D―SDS凝胶电泳可以用于不太复杂的样品(每条带可达15个蛋白质) (Scherl等，2002)。某些极端的蛋白质，如pH值很高或很低的蛋白质，或者膜蛋白，它们都可以用1D―SDS凝胶电泳处理，因为它们常在2D―PAGE技术的标准范围之外(Corthals等，2000)。
